乳腺癌干細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物表達(dá)變化及意義

孫正魁 馬行天 唐 華 姚榛祥

乳腺癌干細(xì)胞能夠發(fā)生侵襲、遷移,從而產(chǎn)生遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移病灶。對乳腺組織和乳腺癌標(biāo)本的基因表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn),CD44+CD24-/low的干細(xì)胞中間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物呈高水平表達(dá)。我們采用乳腺癌干細(xì)胞體外模型,探討乳腺癌干細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物表達(dá)、遷移及侵襲能力的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

人 MCF-7乳腺癌細(xì)胞系購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫,優(yōu)級胎牛血清購自杭州四季青公司,DMEM和DMEM/F12培養(yǎng)基分別購自 Hyclone和 Gibco公司,EGF和 FGF購自 PeproTech公司,超低黏附 6孔培養(yǎng)板購自 Corning公司,CD24-PE和 CD44-FITC抗體購自 BD公司,鼠抗人 E-鈣黏素(E-cadherin)、鼠抗人 N-鈣黏素(N-cadherin)、鼠抗人纖維連接蛋白(Fibronectin)、鼠抗人波形蛋白(Vimentin)、鼠抗人 β-actin單克隆抗體和 HR標(biāo)記的兔抗鼠 Ig多抗購自 Santa cruz公司,Western blot增強(qiáng)放光試劑購自北京中山公司,Transwell小室和 Matrigel購自 BD公司。

1.2 方法

1.2.1 MCF-7細(xì)胞系中乳腺癌干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和傳代 取含血清培養(yǎng)基(為 DMEM培養(yǎng)基,添加了 5 U/L胰島素和 10%的優(yōu)級胎牛血清)中培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的 MCF-7細(xì)胞,用胰酶-EDTA消化成單細(xì)胞懸液。經(jīng)臺盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)后重懸于干細(xì)胞培養(yǎng)基(在 DMEM/F12中添加 5 U/L胰島素、20 U/L EGF和10 U/L bFGF)中,以 1×105個(gè) /ml接種于超低黏附培養(yǎng)板,放入 37℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)板中形成細(xì)胞球后,將其用胰酶-EDTA消化并機(jī)械吹打成單細(xì)胞懸液并重懸于干細(xì)胞培養(yǎng)基中,仍以 1×105個(gè)/ml的濃度接種于超低黏附培養(yǎng)板中。連續(xù)傳代至 5代以上。

1.2.2 乳腺癌干細(xì)胞的有血清誘導(dǎo)分化 將培養(yǎng)出的第 5代細(xì)胞球用 PBS液沖洗后,用胰酶-EDTA消化成單細(xì)胞懸液,重懸于含血清培養(yǎng)基中,單細(xì)胞按照 1×105個(gè)/孔接種于 6孔板。每天用倒置相差顯微鏡觀察其分化和生長情況。當(dāng)細(xì)胞貼壁、分化并處于對數(shù)生長期時(shí)在含血清培養(yǎng)基中連續(xù)傳代。

1.2.3 乳腺癌干細(xì)胞鑒定 取親本 MCF-7細(xì)胞、第 5代 MCF-7微球體細(xì)胞、微球體細(xì)胞分化培養(yǎng)后傳代到第 3代的 MCF-7細(xì)胞,每組細(xì)胞 5復(fù)孔,均經(jīng)胰酶-EDTA消化成單細(xì)胞懸液后,取 5×105的單細(xì)胞均以20μl/m l的濃度加入 CD24-PE和 CD44-FITC抗體進(jìn)行標(biāo)記,避光 20min后用 PBS液洗 2遍,1%的多聚甲醛重懸,FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測。取細(xì)胞球在SSM中貼壁分化的細(xì)胞至第 3代細(xì)胞,采用同樣的方法檢測分化后 CD44+CD 24-細(xì)胞含量。

1.2.4 Western blot檢測 E-鈣黏素 、N-鈣黏素 、纖維連接蛋白、波形蛋白的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染親本 MCF-7細(xì)胞、第 5代 MCF-7微球體細(xì)胞、微球體細(xì)胞分化培養(yǎng)后傳代到第 3代的 MCF-7細(xì)胞,每組細(xì)胞數(shù)為 5×105,用去污劑裂解緩沖液[50 mmoL/L Tris-HCl(pH 8.0),150mmol/LNaCl,1 g/L SDS,100 mg/LPMSF,1 mg/L Aprotinin,10 g/LNP-40]裂解細(xì)胞,提取總蛋白。紫外吸收法進(jìn)行蛋白定量,調(diào)整濃度至 4 g/L。取25μl總蛋白,80 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,轉(zhuǎn)移至 PVDF膜,按蛋白質(zhì)分子質(zhì)量 Marker將 PVDF膜剪開,按次序分別用一抗(鼠抗人 E鈣黏素、鼠抗人 N鈣黏素、鼠抗人纖維連接蛋白、鼠抗人波形蛋白、鼠抗人 β-actin)和二抗(兔抗鼠 IgG-HRP)孵育膜。最后將膜與 Western blot發(fā)光試劑作用,X線膠片曝光,顯影、定影,掃描入計(jì)算機(jī),應(yīng)用 SigmaGel軟件分析相對積分光密度。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。以目的基因的積分光密度/β-actin的積分光密度值為相對光密度值,然后再以親本 MCF-7細(xì)胞的相對光密度值為 1,計(jì)算 MCF-7微球體細(xì)胞、分化的 MCF-7細(xì)胞的 E-鈣黏素、N-鈣黏素、纖維連接蛋白和波形蛋白相對表達(dá)量。

1.2.5 腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)采用帶 12μmol/L孔聚碳酸酯膜的 Transwell小室,下室內(nèi)加入含血清培養(yǎng)基 200μl,上室內(nèi)分別加入各組細(xì)胞 1×104及無血清培養(yǎng)基(為 DMEM培養(yǎng)基,添加了5 U/L胰島素)200μl,每組細(xì)胞 5復(fù)孔。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)預(yù)先用 Matrigel包被 Transwell小室的聚碳酸酯膜,其它步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。Transwell小室放入 37℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中孵育 48 h后取出,切下聚碳酸酯膜,將濾膜底部用 4℃丙酮固定 5 m in,蘇木精染色。在顯微鏡 20倍物鏡視野下計(jì)數(shù)隨機(jī) 5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用 One-Way ANOVA法,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCF-7在無血清懸浮培養(yǎng)下形成能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞球

把 MCF-7細(xì)胞接種于超低黏附培養(yǎng)板的干細(xì)胞培養(yǎng)基中,在不同時(shí)間點(diǎn)用倒置相差顯微鏡觀察 MCF-7細(xì)胞生長情況。24 h后,開始形成少量的細(xì)胞球,但仍有部分細(xì)胞貼壁。72 h后,產(chǎn)生大量的懸浮細(xì)胞球,細(xì)胞球體積明顯增大,基本沒有貼壁細(xì)胞。將細(xì)胞球用胰酶-EDTA消化后并傳代,在用 SFM中可反復(fù)形成細(xì)胞球。用 SSM常規(guī)培養(yǎng)的 MCF-7細(xì)胞在 24 h后全部貼壁,48 h后形成單層細(xì)胞,有少量的懸浮細(xì)胞,但沒有細(xì)胞球形成,見圖 1。

2.2 MCF-7細(xì)胞球在有血清的培養(yǎng)基中貼壁分化

將獲得的細(xì)胞球細(xì)胞接種于含血清培養(yǎng)基中,48 h后,部分細(xì)胞貼壁,仍有大量的懸浮細(xì)胞球。72 h后,細(xì)胞貼壁并與周圍細(xì)胞融合,細(xì)胞形態(tài)在顯微鏡下與在 SSM中常規(guī)培養(yǎng)的 MCF-7細(xì)胞無明顯區(qū)別,見圖1。

圖1 3組細(xì)胞顯微鏡下代表性圖片

2.3 MCF-7細(xì)胞球中 CD44+CD24-細(xì)胞的含量

正常 SSM中培養(yǎng)與用微球細(xì)胞分化培養(yǎng)的細(xì)胞中 CD44+CD 24-細(xì)胞的含量無顯著差異,分別為(2.16±0.33)%和(2.85±0.69)%。而微球體細(xì)胞中CD44+CD24-細(xì)胞的含量顯著增高,為(76.01±4.67)%,與其它 2組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P均＜0.01,3組細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測圖見圖 2。

圖2 3組細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測圖

2.4 MCF-7細(xì)胞球細(xì)胞上皮和間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)

MCF-7微球細(xì)胞中 E-鈣黏素表達(dá)水平下調(diào),與親本 MCF-7和分化后的 MCF-7細(xì)胞比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P均 ＜0.01;而 N-鈣黏素、纖維連接蛋白、波形蛋白的表達(dá)水平上調(diào),與親本 MCF-7和分化后的MCF-7細(xì)胞比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P均 ＜0.05,見圖 3、圖 4。

圖3 3組細(xì)胞上皮及間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)變化

圖4 3組細(xì)胞上皮及間質(zhì)標(biāo)志物電泳圖

2.5 MCF-7細(xì)胞球細(xì)胞的遷移和侵襲能力

Transwell小室穿膜實(shí)驗(yàn)是檢測腫瘤遷移、侵襲能力的體外模型,由圖 5可見,本研究中 MCF-7微球體細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng),與親本 MCF-7和分化后的 MCF-7細(xì)胞比較,微球體細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜和 Matrigel包被的聚碳酸酯膜的能力均顯著增強(qiáng),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P均 ＜0.05。

圖5 3組細(xì)胞的遷移和侵襲能力比較

3 討論

研究顯示腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞系中的細(xì)胞存在著不同分化階段的細(xì)胞,其中有一小部分的腫瘤細(xì)胞充當(dāng)干細(xì)胞的角色,在啟動腫瘤形成和維持腫瘤生長中起決定性作用,被命名為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSC)。2003年 Al-Hajj等[1]在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中分離和鑒定出 CD44+/CD24-/lineage-的乳腺癌細(xì)胞群,這群細(xì)胞只需 200個(gè)就可以在 NOD/SCID鼠中形成腫瘤,而分選出該細(xì)胞群后的剩余的其它細(xì)胞無致瘤性,證實(shí)了乳腺癌干細(xì)胞的存在。隨后的研究發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌患者的骨髓標(biāo)本存在表達(dá) CD44+CD24-的乳腺癌干細(xì)胞,其比例為 33%～l00%,而原發(fā)腫瘤中CD44+CD24-細(xì)胞的比例不超過 10%,提示乳腺癌患者轉(zhuǎn)移灶可能來自乳腺癌干細(xì)胞[2]。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是 1種基本的生理現(xiàn)象,在胚胎發(fā)育過程中參與器官塑型。近年來研究發(fā)現(xiàn),上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮了重要作用[3]。癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化主要特征表現(xiàn)在 E-鈣黏素的表達(dá)下調(diào),上皮細(xì)胞間連接解體,細(xì)胞分散。同時(shí) N-鈣黏素、鈣黏素 6、鈣黏素 11等表達(dá)增強(qiáng),形成細(xì)胞-基質(zhì)黏附。以及間充質(zhì)標(biāo)志纖維連接蛋白、中間絲波形蛋白等表達(dá)上調(diào),細(xì)胞骨架重排,細(xì)胞運(yùn)動能力增強(qiáng)[4]。這樣,癌細(xì)胞丟失上皮細(xì)胞特征、同時(shí)獲得間質(zhì)細(xì)胞的某些特性,游走能力提高、與周邊或遠(yuǎn)處間質(zhì)組織的親和能力增強(qiáng),進(jìn)而造成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

已有研究表明,通過 EMT可使分化的乳腺上皮細(xì)胞獲得了癌干細(xì)胞的特征[5,6]。對正常乳腺組織乳腺癌標(biāo)本進(jìn)行系列基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),CD44+CD24-/low干細(xì)胞高水平的表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志[6]。

我們根據(jù) Pontid等[7]的描述,采用添加細(xì)胞因子的無血清懸浮培養(yǎng)法,成功從 MCF-7乳腺癌細(xì)胞中培養(yǎng)出乳腺微球細(xì)胞。該乳腺微球細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中能夠連續(xù)傳代。該微球體細(xì)胞在有血清培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng),很快分化成貼壁的單層 MCF-7細(xì)胞。我們檢測了第 5代細(xì)胞球的相關(guān)表面標(biāo)志,發(fā)現(xiàn)該微球體細(xì)胞含量約為 76%的 CD44+/CD24-的乳腺癌干細(xì)胞。應(yīng)用這種乳腺癌干細(xì)胞的體外模型,我們采用Western blot方法檢測到 MCF-7微球體細(xì)胞 E-鈣黏素表達(dá)下調(diào),而 N-鈣黏素、纖維連接蛋白、波形蛋白的表達(dá)上調(diào),而 MCF-7微球體細(xì)胞分化后的 MCF-7細(xì)胞中E鈣黏素、N鈣黏素、纖維連接蛋白、波形蛋白的表達(dá)水平與親本 MCF-7細(xì)胞比較無顯著差別。我們的研究還發(fā)現(xiàn),與親本 MCF-7和分化后的 MCF-7細(xì)胞比較,MCF-7微球體細(xì)胞表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的遷移和侵襲能力。說明乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)培育產(chǎn)生乳腺癌干細(xì)胞過程中發(fā)生了EMT,可能是乳腺癌干細(xì)胞獲得侵襲、轉(zhuǎn)移能力的基礎(chǔ)。因此,對乳腺癌干細(xì)胞與 EMT的關(guān)系的深入研究,可能為乳腺癌治療提供新的方向。

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