“基因工程”專題疑難問題解析

這兩年在講授人教版選修3《現代生物科技專題》的“基因工程”專題部分時，發現無論是部分老師，還是學生對其中的有關問題，都存在著或多或少的疑問，現收集教學一線碰到的以下問題逐一進行解析，供同行參考。

問題1：在現代生物技術應用中，利用最多的就是在細菌細胞中生產真核蛋白，比如人胰島素和生長激素。但是，真核基因的核基因序列卻很少直接用來做表達蛋白質的工作，這是為什么?

解析：在細菌等原核細胞中，結構基因通常指一個DNA片段，它可以轉錄產生mRNA分子。mRNA分子通過翻譯合成細胞中所需的蛋白質(圖1)。在真核細胞中，基因的結構相對要復雜一些(圖2)。真核基因的編碼區域(外顯子)往往被一些非編碼區域(內含子)所分開，因此，在一個完整的真核基因轉錄以后，內含子要被剪切刪除掉，再把外顯子連起來，這個過程稱為剪切，屬于轉錄后加工。剪切之后就能產生有功能的mRNA。遺憾的是細菌無法有效地去除內含子，剪切連接外顯子。因此，真核基因的核基因序列很少直接用來做表達蛋白質的工作。

人們一般都愿意把真核細胞的mRNA反轉錄成雙鏈的互補DNA(cDNA)，然后再放到原核宿主細胞DNA調控序列的后面表達，從而簡化它的轉錄以及翻譯過程。

問題2：如何通過cDNA方法獲得真核生物目的基因?

解析：cDNA合成過程大致如圖3所示。

第一步，反轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。

第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。

第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。

問題3：為什么細菌中限制酶不剪切細菌本身的DNA?

解析：迄今為止，基因工程中使用的限制酶絕大部分都是從細菌或霉菌中提取出來的，它們各自可以識別和切斷DNA上特定的堿基序列。細菌中限制酶之所以不切斷自身DNA，是因為微生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，可以將外源入侵的DNA降解掉。生物在長期演化過程中，含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵，達到保護自身的目的。

問題4：為什么在分子克隆實驗中使用最普遍的是那些識別4個或6個堿基對的限制性內切酶?

解析：限制性內切酶的識別位點可以是4個、5個、6個、8個甚至更多的堿基對(表1)。由于限制性內切酶的識別位點在DNA分子中出現的頻率不同，即識別位點序列短的限制性內切酶就會更頻繁地切割DNA分子，因此，在分子克隆實驗中使用最普遍的是那些識別4個或6個堿基對的限制性內切酶。

問題5：如何構建基因文庫?

解析：在原核生物中，結構基因通常會在基因組DNA上形成一個連續的編碼區域，但在真核細胞中，外顯子往往會被內含子分開。因此在處理原核基因和真核基因的分離時，要分別采取不同的克隆步驟。

在原核細胞中，目的DNA通常在總的染色體DNA中的含量非常少(小于0.02％)。要克隆原核基因，首先要用限制性內切酶對總DNA酶解，然后把這些酶解的DNA片段克隆轉進載體，再對帶有外源DNA片段的重組克隆進行鑒定、分離、再培養和進一步鑒定。整個過程稱為基因文庫的構建。從定義上講，一個完整的基因文庫應該包括目的生物體所有的基因組DNA。

構建基因文庫大多采用一種識別4個堿基序列的限制性內切酶(如Sau3A I)進行酶解，理論上講它應該是每256個堿基就切一次，調整酶解反應的條件可以使它部分酶解基因組DNA，產生出所有的可能大小的片段(圖4)。由于限制性內切酶的位點在基因組DNA上并不是隨機排列的，有些片段可能會太大而無法克隆，這時文庫就不完整，要找到某一個特異的目的DNA片段也許就要難一些。

問題6：目的基因為何必須和運載體結合形成重組DNA才導人受體細胞?

解析：基因表達載體構建的目的是使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發揮作用。要想使新的重組DNA分子在宿主細胞中保存下去，就要求這兩個不同來源的DNA分子中至少有一個分子必須提供其在細胞中保存下來所需的生物學功能，這個分子就是基因工程中常用的載體。

問題7：運輸基因的載體上為何常帶有一個或多個標記基因?

解析：運載體上的特殊的遺傳標記基因，可供重組DNA的鑒定與選擇。這里以外源DNA插入到pBR322的Barn HI位點中為例來加以說明：圖5是pBR322質粒結構示意圖：pBR322質粒含有兩個抗生素抗性基因(抗氨芐青霉素和抗四環素)；還有單一的Barn Hl、HindⅢ和Sal I的識別位點，這3個位點都在四環素抗性基因內；另一個單一的Pst I識別位點在氨芐青霉素抗性基因內。pBR322帶有一個復制起始位點，它可以保證這個質粒只在大腸桿菌里行使復制功能。

轉化之后，就要對含有外源DNA的重組質粒進行鑒定。可以通過以下步驟來鑒別：先將轉化的細胞涂布在一個含有氨芐青霉素的培養基上，只有那些帶有完整的pBR322質粒或是插入有外源DNA片段的pBR322質粒的細胞可以在培養基上生長；沒有轉化的細胞就會被氨芐青霉素殺死。由于Bam Hl位點是在四環素抗性基因中，因此，如果DNA插入到這個基因中，就會破壞四環素抗性基因，四環素的抗性就會丟失，所以帶有外源DNA的質粒的受體細胞對氨芐青霉素有抗性，但對四環素沒有抗性。那些帶有自身環化的質粒DNA的細胞既有氨芐青霉素的抗性，同時也有四環素抗性。

第二步是把長在含有氨芐青霉素的培養基上的克隆轉移到含有四環素的培養基上，如果在含有四環素的平板上生長，該克隆就帶有自身環化的pBR322，因為這些細胞對兩種抗生素都有抗性。而那些只在氨芐青霉素平板上生長，而在四環素平板上不能生長的克隆就是帶有外源DNA的重組質粒的克隆。重復第二步篩選步驟，就可以較為確定地篩選出那些帶有特異地插入的外源DNA的重組質粒。在pBR322質粒上的HindⅢ和Sal I的位點也同樣可以作為克隆的位點。

問題8：天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎?為什么?

解析：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質粒，即獨立于細菌擬核處染色體DNA之外的一種可以自我復制、雙鏈閉環的裸露的DNA分子。是否任何質粒都可以作為基因工程載體使用呢?其實不然，作為基因工程使用的載體必須滿足以下條件。

(1)載體DNA必須有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點所處的位置，還必須是在質粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插人而失活。

(2)載體DNA必須具備自我復制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復制而同步復制。

(3)載體DNA必須帶有標記基因，以便重組后進行重組子的篩選。

(4)載體DNA必須是安全的，不會對受體細胞有害，或不能進入到除受體細胞外的其他生物細胞中去。

(5)載體DNA分子大小應適合，以便提取和在體外進行操作，太大就不便操作。

實際上自然存在的質粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進行人工改造后才能用于基因工程操作。

問題9：轉基因技術中為什么常常選擇在動物乳汁中生產重要的醫用蛋白?

解析：人們之所以要選擇乳腺來生產藥物蛋白，原因很多。首先，乳汁可以由乳腺不斷地分泌，而且產量很高，長期收集也不會對動物造成傷害；其次，將新的藥物蛋白限制在乳腺內生產，最后分泌到乳汁中，一般不易對轉基因動物的正常生理活動造成影響。此外，乳腺分泌的蛋白質是經過正常的高等哺乳動物的翻譯后加工的，這使得生產的藥物蛋白更接近于人類自身的蛋白質。再有，乳汁中蛋白純化起來相對較為容易，而且在乳汁中含有的其他蛋白質也不多。

問題10：利用顯微注射法注入外源基因后培養獲得的轉基因小鼠為什么并不都產生預期的性狀?

解析：由于微注射法所注射的DNA在宿主基因組中是隨機整合的，并且有可能發生多個拷貝插入同一位點的情況，因此轉入基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，從而干擾該基因的正常表達，影響轉基因動物的正常發育和代謝。另外，有的外源基因的表達具有時間性，得到的轉基因動物可能只在一段時期內表達外源基因；有些個體可能因基因插入位點不合適而無法表達產物；還有些個體基因拷貝數過多導致表達過量，干擾自身的正常生理活動。因此，并不是所有的轉基因小鼠都能產生預期的性狀。由于這些原因，DNA微注射法的總效率還是比較低，但是這種方法仍然是目前獲得轉基因鼠的常規方法。

問題11：如何利用染色體上整合了外源基因的轉基因鼠獲得純合的轉基因鼠?

解析：將轉基因鼠之間進行雜交，子代再配對雜交。根據孟德爾遺傳定律，將有1／4的可能獲得純合的轉基因鼠(轉入基因可以和正常基因一樣分離)，如圖6所示。

問題12：Bt毒蛋白基因是目前世界范圍內培養轉基因植物使用最廣泛、最有潛力的一個抗蟲基因，但使用過程中也存在不少問題，首先，Bt毒蛋白基因的抗蟲譜窄，每一種毒素基因只能針對一類害蟲；其次，隨著轉Bt毒蛋白基因植物的大面積種植，給昆蟲造成很高的選擇壓力，可能很快會使昆蟲對此毒蛋白產生抗性。針對這些情況，人們可以采取哪些應對措施?

解析：人們需要對大田種植轉基因作物后的昆蟲數量加以密切監測，以便跟蹤了解抗性昆蟲的產生頻率。如果產生抗性昆蟲的頻率很高，那么最終可能會需要效力更強的蘇云桿菌原毒素，甚至需克隆其他的殺蟲基因來轉化植物。針對以上問題，人們采取了一些措施，主要包括以下5點：

(1)分離新的Bt毒蛋白基因。抗蟲基因越多，可供選擇的范圍就越廣。

(2)對Bt毒蛋白基因進行分子改造，提高其表達量。如使用高效表達啟動子，或者使用植物偏愛密碼子，或者對不同來源的Bt毒蛋白基因進行人工拼接和重組。

(3)同時使用兩個以上的Bt毒蛋白基因轉化農作物，或將Bt毒蛋白基因與其他抗蟲基因聯合進行轉基因。

(4)使Bt毒蛋白基因只在容易被害蟲侵染組織器官中特異表達，或者只在發育的某個階段，或受傷時表達，稱為降壓法，即降低對昆蟲的選擇壓力，以降低抗性昆蟲出現的頻率。

(5)用不同表達水平來控制。用Bt毒蛋白基因表達量很高的植物以殺死任何可能產生抗性的昆蟲，或用低致死量的轉基因植物抑制昆蟲生長，以利于其他天敵對其捕食。

同時，在大田里種植轉基因抗蟲作物時，還可以考慮以下措施：

(1)輪換法：抗蟲基因作物與化學殺蟲劑交替使用，使毒素基因表達產物對昆蟲的選擇壓力間斷；

(2)避護法：轉基因作物與非轉基因作物混播，使抗蟲昆蟲品系難以發展；

(3)淘汰法：在昆蟲抗性產生以前，淘汰此種抗蟲作物。