高效液相色譜法測定飼料中替米考星含量

北京市獸藥監(jiān)察所 閆小峰 孫志文

替米考星是一種以泰樂菌素為前體半合成的畜禽專用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，且由順式和反式兩種異構(gòu)體以85∶15的比例混合而成的白色粉末，在甲醇、乙腈、丙酮中易溶，在乙醇、丙二醇中溶解，在水中不溶，主要用于治療豬胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌及支原體引起的感染（中國獸藥典委員會(huì)，2006）。 李秀紅等（2006）指出，動(dòng)物性產(chǎn)品中替米考星殘留會(huì)對人類造成致敏性、毒性反應(yīng)，長期食用還會(huì)改變?nèi)祟惸c道菌群失調(diào)，產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性。近年來，已建立了水產(chǎn)品、羊乳、豬組織等多種動(dòng)物性產(chǎn)品中替米考星殘留檢測方法（蘇秀華等，2009；王雪敏等，2009；李存等，2005；農(nóng)業(yè)部958號公告-1-2007；農(nóng)業(yè)部1025號公告-10-2008），但飼料中替米考星檢測僅為國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法（農(nóng)業(yè)部783號公告-4-2006）。本實(shí)驗(yàn)旨在建立一套簡便、靈敏、準(zhǔn)確的飼料中替米考星的檢測方法，以更好地滿足我國飼料質(zhì)量檢測的要求。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 離心機(jī)（CF16RX HITACHI）、渦旋混合器（MS3 IKA）、振蕩器（KS 260 IKA）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（B-490 BUCHI）、超純水機(jī)（Milli-Q Millipore）、高效液相色譜儀（Waters 2695 996二極管陣列檢測器）。替米考星標(biāo)準(zhǔn)品（純度91.0%，批號：K0310711，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所），C18固相萃取柱：500 mg/6 mL，乙腈、四氫呋喃為色譜醇，其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 主要溶液配制

1.2.1 10%磷酸溶液：取100 mL磷酸緩慢加入900 mL水中，邊加邊攪拌，用水稀釋至1000 mL。

1.2.2 二丁胺磷酸緩沖液（1 mol/L）：取10%磷酸溶液700 mL，緩慢加入168 mL二丁胺，邊加邊攪拌。冷卻至室溫，用85%磷酸調(diào)pH至2.5，加水稀釋至1000 mL。

1.2.3 流動(dòng)相（乙腈-四氫呋喃-1 mol/L二丁胺磷酸鹽緩沖液，130∶55∶25，V/V/V）：分別量取130 mL乙腈、55 mL四氫呋喃、25 mL二丁胺磷酸鹽緩沖液，依次加入700 mL水中，用水稀釋至1000 mL，0.45 μm 濾膜過濾。

1.2.4 洗脫液（0.1 mol/L乙酸胺甲醇-乙腈，20∶80，V/V）：稱取7.71 g乙酸胺溶解于200 mL甲醇中，加790 mL混勻，冷卻至室溫，用乙腈稀釋至1000 mL。

1.2.5 磷酸二氫鉀緩沖液：稱取13.61 g磷酸二氫鉀溶解于800 mL水中，用磷酸調(diào)pH值至2.5，再用水稀釋至1000 mL。

1.2.6 替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 mg/mL）：精密稱取替米考星標(biāo)準(zhǔn)品約55 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋到刻度。

1.3 色譜條件 色譜柱：C18柱 5 μm，250 mm×4.6 mm i.d.（Symmetry Waters）；檢測波長：290 nm；流動(dòng)相：乙腈-四氫呋喃-1 mol/L二丁胺磷酸鹽緩沖液（130∶55∶25，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4 樣品處理

1.4.1 提取：稱取2 g飼料樣品（精確至0.01 g），置于50 mL離心管中，加入 8 mL乙腈，渦旋1 min，中速振蕩 20 min，10000 r/min 離心 10 min，取上清液于50 mL離心管中，殘?jiān)幸来渭尤? mL磷酸二氫鉀緩沖液和8 mL乙腈，渦旋1 min，中速振蕩20 min，10000 r/min離心10 min，合并兩次上清液，10000 r/min離心5 min，取上清液于100 mL燒杯中，加水40 mL混勻，為樣品提取液。

1.4.2 凈化：將C18固相萃取柱，依次用10 mL甲醇和10 mL水平衡，將樣品提取液過柱，自然流干，再依次用10 mL水和10 mL乙腈洗滌，抽真空干燥5 min，用5 mL洗脫液洗脫，收集洗脫液，30℃水浴中氮?dú)獯蹈伞＜?.0 mL流動(dòng)相溶解，經(jīng)微孔濾膜過濾，供高效液相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系 用流動(dòng)相將替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成濃度為1、5、10、50、100 μg/mL 和500 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)，在選擇的色譜條件下，進(jìn)樣20 μL，觀察峰面積（順式和反式異構(gòu)體的峰面積之和，y）與濃度（x，μg/mL）之間的關(guān)系，結(jié)果見圖1。由圖1可得回歸方程y=20984x-936.25，相關(guān)系數(shù)r=1。

1.2 臨床資料收集 收集所有患者入急診科后的基礎(chǔ)臨床數(shù)據(jù)，包括病史、年齡、性別、心電圖、高血壓病、糖尿病、高脂血癥等，所有病例入院當(dāng)天急診抽血查肌鈣蛋白Ⅰ，分別運(yùn)用 HEART評分和MEWS評分進(jìn)行病情評估。

2.2 檢測限 在本實(shí)驗(yàn)的色譜條件下，信噪比S/N=3時(shí)，替米考星的最低檢測濃度為1 μg/g。

2.2 方法的準(zhǔn)確度——回收率實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取2 g陰性飼料，分別添加不同濃度的替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成樣品濃度為 10、100 μg/g 和 400 μg/g的樣品，每個(gè)濃度做5個(gè)平行，在本實(shí)驗(yàn)分析條件下進(jìn)行測定，結(jié)果見表1，色譜圖見圖2～圖4。結(jié)果可知，平均回收率為81.4%～92.6%，變異系數(shù)分別為6.1%、4.8%、1.9%。

圖1 替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線

表1 回收率及變異系數(shù)（n=5）

圖2 替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（10 μg/mL）

圖3 空白飼料樣品色譜圖

圖4 添加樣品色譜圖（10 μg/mL）

2.3 方法的精密度實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取2 g陰性飼料5份，添加替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成樣品濃度為100 μg/g的樣本，在本實(shí)驗(yàn)分析條件下進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。由表2可知，變異系數(shù)為4.8%。

2.4 波長選擇 替米考星標(biāo)準(zhǔn)溶液在本實(shí)驗(yàn)分析條件下，用二極管光陣列檢測器采集波長210～400 nm的紫外吸收光譜圖，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，最大吸收波長為289.1 nm，因此選擇290 nm處測定。

2.5 流動(dòng)相的確定 本實(shí)驗(yàn)采用乙腈-四氫呋喃-1 mol/L二丁胺磷酸鹽緩沖液經(jīng)一定的配比制成的流動(dòng)相，通過調(diào)整配比，發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈-四氫呋喃-1 mol/L 二丁胺磷酸鹽緩沖液（130∶55∶25，V/V/V），流速為1.0 mL/min時(shí)，替米考星的保留時(shí)間比較合適，并避免了雜質(zhì)峰的干擾。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 替米考星標(biāo)準(zhǔn)品光譜圖（10 μg/mL）

2.6 柱溫的確定 分別對柱溫20、25℃和30℃進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種溫度替米考星分離效果均良好，30℃時(shí)保留時(shí)間最短，20℃時(shí)保留時(shí)間最長。綜合分析，對柱溫不做要求。

2.7 提取液的選擇 本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯和乙腈-磷酸鹽緩沖液作為提取液，試驗(yàn)結(jié)果表明，先用乙腈提取，再用磷酸鹽緩沖液和乙腈的混合溶液提取，雜質(zhì)少，回收率高。樣品提取液在固相萃取柱前加水稀釋，是為了增加溶液的極性，使藥物更好的被SPE柱吸附。

2.8 萃取柱的選擇 比較了不同填料的SPE柱，如 C18、HLB、MAX、MCX，最終選擇了 C18（500 mg/6 mL）固相萃取柱，該萃取柱回收率高，凈化效果好。樣品通過SPE柱時(shí)，流速控制在15～20滴/min。流速過快，回收率低，流速過慢，結(jié)果重復(fù)性差。

2.9 離心速度的確定 飼料本身比較松散，離心時(shí)如果速度過低，就不能有效地將提取液與飼料樣本有效地分開，導(dǎo)致提取液不能有效地轉(zhuǎn)移，影響回收率，如果轉(zhuǎn)移時(shí)轉(zhuǎn)移了一些飼料固體，那么會(huì)給樣品凈化帶來困難。再由于飼料本身含有大量的蛋白質(zhì)，通過高速離心的方式也可起到沉淀蛋白質(zhì)的作用，因此，本實(shí)驗(yàn)條件下將離心轉(zhuǎn)速定為10000 r/min。

3 結(jié)論

與國家標(biāo)準(zhǔn)方法比較，本方法改變了提取液，增加了固相萃取凈化步驟，優(yōu)化了色譜條件。本實(shí)驗(yàn)方法靈敏度高，凈化效果好，回收率高（81.4%以上），重復(fù)性好，能夠滿足飼料中替米考星的檢測需要。

[1]李存，沈建中，江海洋，等.豬組織中替米考星的高效液相色譜檢測方法研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，36（10）：1075 ～1078.

[2]李秀紅，張煌濤，占秀梅，等.動(dòng)物性食品中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留分析綜述[J].草原家畜，2006，3：10 ～12.

[3]蘇秀華，吳成業(yè)，錢卓真.水產(chǎn)品中替米考星殘留分析方法的探討[J].福建水產(chǎn)，2009，3：30 ～33.

[4]王雪敏，石玉祥，李存.羊乳中替米考星殘留檢測方法研究[J].食品科學(xué)，2009，30（14）：207 ～209.

[5]中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典獸藥使用指南化學(xué)藥品卷2005年版[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[6]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部1025號公告-10-2008.動(dòng)物性食品中替米考星殘留檢測高效液相色譜法[S].2008-04-29.

[7]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部783號公告-4-2006.飼料中替米考星的測定 高效液相色譜法[S].2006-12-19.

[8]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部958號公告-1-2007.牛奶中替米考星殘留量的測定高效液相色譜法[S].2007-12-29.