飼料級大豆磷脂中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的檢測研究

上海市農科院農產品質量標準與檢測技術研究所 楊海鋒 趙志輝 顧賽紅 邢增濤

磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇是大豆磷脂中最重要的活性成分，其所占比重的高低，是衡量大豆磷脂品質優劣的一個重要標準（章慧芳和陸婭，2007）。隨著大豆磷脂市場需求的不斷擴大，經常發生大豆磷脂產品的貿易糾紛。廣大生產企業和用戶都希望對大豆磷脂中的有效成分磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇進行檢驗和檢測。國內外研究報道的大豆磷脂的檢測方法主要是定磷法、薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）等（張穎穎等，2006；卜延剛等，2004）。定磷法需要消化、顯色等過程，操作繁瑣、耗時。薄層色譜法干擾因素多，靈敏度不高，顯色后定量誤差較大而主要用于定性分析。高效色相色譜法以其高速、高效、高靈敏度、系統封閉避免不飽和鍵氧化等優點，受到普遍關注（董曉渭等，2000；Mounts和Nash，1990）。然而由于研究者應用的前處理技術、檢測方法都不相同（張德權等，2006；Rombaut等 ，2005；Singleton 和 Stikeleather，1995；Becart等，1990），即使都使用HPLC技術，但分離柱、填料、流動相也存在差異，缺乏一個統一的標準。而不同的前處理方法和檢測技術會對檢測結果產生一定的影響，因此迫切需要建立統一的飼料級大豆磷脂中主成分的檢測方法。本研究探討了應用高效液相色譜法同時檢測飼料添加劑大豆磷脂中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗中所用的大豆磷脂產品來自國內6個主要大豆磷脂廠商的6個不同批次的產品，因此所選樣品具有廣泛的代表性。

1.2 試劑及儀器 正己烷：色譜純；異丙醇：色譜純；冰乙酸：色譜純；1%冰乙酸溶液：1 mL冰乙酸用色譜純水定容到100 mL；磷脂酰膽堿（PC）：標準物質，純度 ≥ 99%；磷脂酰乙醇胺（PE）：標準物質，純度 ≥ 99%；磷脂酰肌醇（PI）：標準物質，純度≥98%。高效液相色譜儀：配有四聯泵、柱溫箱、紫外檢測器（206 nm）。所用的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇標樣來源應與所測定的樣品一致，如測定的樣品為大豆磷脂時，上述三種標樣應來源于大豆。

1.3 標準溶液配制 精確稱取約20 mg磷脂酰膽堿、20 mg磷脂酰乙醇胺與10 mg磷脂酰肌醇，用正己烷∶異丙醇∶1%冰乙酸溶液為 8∶8∶1（V∶V∶V）混合溶液溶解并定容于10 mL容量瓶中搖勻，溶液中 PC、PE、PI濃度分別為 2、2 mg/mL 和 1 mg/mL。準確吸取此溶液 0.25、1.25、2.50、3.75 mL 和 5.0 mL，并用正己烷∶異丙醇∶1%冰乙酸溶液為 8∶8∶1（V∶V∶V）混合溶液定容至5 mL，使溶液中磷脂酰膽堿的最終濃度為0.1～2.0 mg/mL、磷脂酰乙醇胺的最終濃度為0.1～2.0 mg/mL、磷脂酰肌醇的最終濃度為0.05～1.0 mg/mL。過0.45 μm孔徑濾膜。低于-16℃保存備用，保存時注意容器口的密封。如標樣為三氯甲烷或甲醇溶解的溶液，必須將其中的溶液用氮氣吹干，再用流動相溶解定容。

1.4 試樣制備 依據樣品中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇含量，稱取0.1～0.5 g（精確到0.0001 g）試樣，用正己烷∶異丙醇∶1%冰乙酸溶液為 8∶8∶1（V∶V∶V）混合溶液溶解并定容于 10 mL容量瓶中。于渦旋振蕩器上渦旋振蕩，混勻后，置超聲波清洗器中超聲30 min（期間每10 min取出混勻一次）。取少量試液于離心管中，以3600 r/min離心分離15 min，取2 mL上清液過0.45 μm孔徑濾膜，制得試樣待測液進行色譜測定。低于-16℃保存備用，保存時注意容器口密封。

1.5 液相色譜條件 硅膠柱：硅膠柱，長250 mm，內徑 4.6 mm，粒度 5 μm，或相當者；柱溫：30 ℃；流動相：正己烷∶異丙醇∶冰乙酸溶液為 8∶8∶1（V∶V∶V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：206 nm；進樣體積：10 μL。

1.6 液相色譜測定 用高效液相色譜儀分別對標準品溶液和樣品溶液進行檢測，測定其色譜峰面積的響應值，進行定量計算。對同一樣品至少進行兩次測定。

2 結果與分析

2.1 方法重復性 結果見表1。由表1可見，本方法中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的測定結果的相對標準偏差均小于4%，因此應用本檢測方法測定大豆磷脂中三種主成分含量有較好的精密度。

2.2 回收率 結果見表2。

對大豆磷脂樣品進行添加回收試驗，稱取約100 mg大豆磷脂樣品，用正己烷∶異丙醇∶1%冰乙酸溶液為 8∶8∶1（V∶V∶V）混合溶液溶解并定容至10 mL，稱取10 mg磷脂酰膽堿、10 mg磷脂酰乙醇胺、5 mg磷脂酰肌醇標樣，用混合流動相溶液溶解并定容于5 mL容量瓶中。分別取1 mL樣品溶液和1 mL的大豆磷脂標樣溶液于5 mL容量瓶中定容，過0.45 μm膜，裝入樣品瓶內，待測，回收率計算公式如下：

表1 方法重復性試驗

表2 樣品的回收率

回收率=（測定值-試樣中大豆磷脂含量）/添加大豆磷脂含量。

表2的測定結果表明，此方法中飼料級大豆磷脂三種主成分含量的回收率均在96%～103%，因此應用本檢測方法測定大豆磷脂中三種主成分含量有較好的準確度。

2.3 磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇同時測定 選用國內6個不同廠家生產的大豆磷脂產品，測定其磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇含量，三者總和見表3。《美國中央大豆公司磷脂指南》中大豆磷脂的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇含量分別約為16%、14%和9%，本試驗結果與其基本相符。

表3 不同產品中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇含量總和的檢測比較 %

3 結論

本實驗中所采用的飼料級大豆磷脂中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇的高效液相色譜檢測方法，檢測結果穩定、精確、可靠、可操作性強，為國內飼料添加劑大豆磷脂產品中主要活性成分檢測提供很好借鑒。

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