丙泊酚對腦缺血再灌注時 caspase-3和相關因子的影響

辛險峰,王進全,左會明,王新程,周 雷

(1.佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學在讀研究生,黑龍江 佳木斯 154007)

丙泊酚(P,propofol)作為一種新型的靜脈麻醉藥,因起效快、蘇醒迅速而完全、副作用小,連續靜脈輸注后無蓄積作用等優點,現已經普遍用于臨床需要做手術的全身麻醉,包括門診的小手術、無痛人流和無痛胃腸鏡檢查等。丙泊酚對缺血再灌注損傷(IRI,ischemia reperfusion injury)的組織或器官有保護作用已經從臨床和實驗研究中得到證實。本實驗是關于丙泊酚對大鼠腦缺血再灌注時細胞凋亡(apoptosis)和相關因子影響的進一步探討。

1 材料和方法

1.1 材料

Bax兔抗鼠單克隆抗體(SC-526),Bcl-2兔抗鼠多克隆抗體(SC-492),Caspase-3兔抗人多克隆抗體(SC-7148),二步法免疫組織化學檢測試劑(PV-9001),DAB顯色劑 (ZLI-9018),(TUN EL)原位細胞凋亡檢測 (ZK-8005),以上試劑均購于北京中杉金橋生物技術公司,丙泊酚注射液(西安力邦制藥有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組

雄性 Wistar大鼠 78只 ,體重 230～ 250g,鼠齡 3～ 4個月 ,由佳木斯大學實驗動物中心提供。隨機分為3組:對照組(C=6),缺血組(I/R=36),丙泊酚組(P=36);缺血組和丙泊酚組又根據再灌注的時間不同分為再灌注1h,6h,12h,24h,48h,72h亞組。

1.2.2 模型制備

采用大鼠四條血管阻斷方法(Pulsinelli-4V O)[1]制備大鼠全腦缺血再灌注模型。大鼠用10%水合氯醛380mg/kg腹腔注入麻醉后,將大鼠俯臥固定 ,備皮,消毒。在枕骨下于平行脊柱沿頸背正中線切開皮膚,皮下肌肉至第一頸椎,找到后弓上的翼突孔,按其解剖位置將燒灼的細針直接插入雙側翼突孔,插入時間在 1～ 2秒即可。并電凝燒閉椎動脈;次日用同樣的麻醉方法處理大鼠后,在頸部正中切口,于雙側頸動脈鞘出分離雙側頸動脈,在雙側頸動脈環繞絲線并提出頸動脈,用臨時阻斷夾夾閉頸總動脈造成全腦缺血15min,15min后松開阻斷夾恢復再灌注。P組于缺血前10min腹腔注入丙泊酚110mg/kg,I/R組在缺血前10min腹腔注入等溶劑的生理鹽水。C組不電凝雙側椎動脈,不夾閉雙側頸總動脈,其余處理與手術組相同。

1.2.3 標本制作

于再灌注時間點麻醉動物,迅速剪開胸腔暴露心臟,于心尖處剪一小口,插入軟管至主動脈,絲線結扎固定,剪開右心耳快速向心臟推注肝素化生理鹽水,沖凈血液后,以。4℃4%多聚甲醛灌流30min,斷頭取腦,由視交叉平面冠狀切取約 4mm組織塊,置4%多聚甲醛固定、脫水、透明、石蠟包埋,切片機做連續冠狀面切片。

1.2.4 免疫組化及 TUN EL法檢測

免疫組化法檢測 Bax,Bcl-2,Caspase-3蛋白在大鼠海馬 CA1區的表達情況,TUN EL法檢測其細胞的凋亡數。

1.2.5 數據收集

在 400倍光鏡下計數 CA1區細胞總數和陽性細胞數,計算陽性率(陽性率=陽性細胞數 /總細胞數× 100%)。每張切片計數4個不重疊視野,取平均值。

1.3 統計學處理

采用 SPSS17.0軟件進行統計處理,數據均用均數±標準差表示。組間比較采用方差分析。P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

見表 1。

表1 各組海馬區 BcL-2,Bax,Caspase-3及 TUNEL陽性細胞數 (±s)

表1 各組海馬區 BcL-2,Bax,Caspase-3及 TUNEL陽性細胞數 (±s)

① Bcl-2組間比較:相同時間點 P和 I/R的比較:P72h V S I/R72h;P48h V S I/R48h;P24h VS I/R24h;P12h VS I/R12h;P6h V S I/R6h;P1h V S I/R1h(P ＜0.05)。② Bax組間比較:相同時間點 P和 I/R的比較:P72h V S I/R72h;P48h VS I/R48h;P24h V S I/R24h;P12h V S I/R12h;P6h VS I/R6h;P1h V S I/R1h(P＜ 0.05)。③ Caspase-3組間比較:相同時間點 P和 I/R的比較,P72h V S I/R72h;P48h VS I/R48h;P24h V S I/R24h;P12h VS I/R12h;P6h V S I/R6h;P1h VS I/R1h(P ＜0.05)。④ TUN EL組間比較:相同時間點 P和 I/R的比較:P72h V S I/R72h:P48h V S I/R48h;P24h V S I/R24h;P12h VS I/R12h;P6h V S I/R6h;P1h V S I/R1h(P ＜ 0.05)。⑤ Bcl-2組內不同時間點比較:I/R1h V S I/R6h、 I/R12h、 I/R24h、I/R48h、 I/R72h(P ＜ 0.05)。 ,I/R24h VS I/R48h、I/R72h(P ＜ 0.05);P1h V S P6h、 P12h、 P24h、P48h、 P72h、P ＜ 0.05,P24h VS P48h、P72h(P ＜ 0.05)。⑥ Bax組內不同時間點比較:I/R1h V S I/R6h、I/R12h、I/R24h、I/R48h、I/R72hP ＜ 0.05,I/R24h VS I/R48h、 I/R72h(P ＜ 0.05);P1h V S P6h(P ＞ 0.05),P1h V S P12h、 P24h、 P48h、P72h、 (P ＜ 0.05),P24h V S P48h、P72h(P ＜ 0.05)。⑦ Caspase-3組內不同時間點比較:I/R1h V S I/R6h、 I/R12h、I/R24h、 I/R48h、 I/R72h(P ＜ 0.05),I/R24h V S I/R48h、I/R72h P ＜ 0.05;P1h V S P6h(P＞ 0.05),P1h VS P12h、P24h、 P48h、P72h、 (P ＜ 0.05),P24h V S P48h、 P72h(P ＜ 0.05)。⑧ TUNEL組間不同時間點比較:I/R1h V S I/R6h、I/R12h、I/R24h、I/R48h、I/R72h(P ＜ 0.05),I/R24h VS I/R48h(P ＜ 0.05),I/R24h V S I/R72h(P＞ 0.05);P1h V S P6h(P ＜ 0.05),P1h V S P12h、P24h、 P48h、P72h、 (P ＜ 0.05),P24h VS P48h、P72h(P ＜ 0.05)。

組別 BcL-2 Bax Caspase-3 TUNEL Bcl-2/Bax I/R1h 9.81± 0.78 27.42± 0.54 27.05± 0.70 37.76± 0.72 0.36 I/R 6h 25.35± 0.59 37.04± 1.16 30.47± 1.62 42.04± 1.09 0.68 I/R 12h 36.09± 0.71 45.04± 1.55 34.60± 0.93 45.84± 1.35 0.80 I/R24h 29.59± 1.89 56.13± 1.26 42.80± 1.22 71.55± 1.72 0.53 I/R 48h 19.96± 0.91 35.92± 1.40 44.52± 0.90 75.45± 2.83 0.56 I/R72h 15.14± 0.44 22.73± 1.92 35.87± 0.87 57.48± 5.36 0.67 P 1h 14.06± 0.70 21.56± 1.14 25.07± 0.79 35.49± 0.42 0.65 P 6h 32.23± 1.71 20.88± 1.00 23.77± 0.95 32.73± 1.41 1.54 P 12h 43.46± 1.11 18.91± 0.94 20.52± 1.13 29.91± 0.41 2.30 P 24h 34.57± 1.46 15.81± 0.76 17.62± 0.99 28.06± 1.09 2.19 P48h 28.41± 1.01 13.43± 1.06 15.12± 1.14 25.16± 0.28 2.12 P 72h 20.35± 1.81 10.19± 1.82 12.27± 1.80 21.23± 1.2 72.00

3 討論

在心肺復蘇、器官移植、溶栓術、冠脈搭橋術、危重病人存在血流灌注不足時以及臨床上腦外科手術麻醉和腦梗死患者不可避免引起 IRI。缺血可以產生炎癥前反應,再灌注時進一步加重了組織損傷,因此防止器官 IRI是醫生面臨最嚴峻的問題。細胞凋亡是細胞在基因的調控下主動性程序性死亡,受促進凋亡基因和抑制凋亡基因的協調及雙重調控。Bax是 Bcl-2家族成員之一。當在外界因素的作用下促使Bcl-2高表達,則 Bax蛋白與 Bcl-2和 Bcl-XL蛋白形成異源二聚體可阻止細胞的凋亡發生;但假如 Bax蛋白過度表達導致 Bax和 Bcl-2,Bcl-XL形成同源二聚體而促進細胞的凋亡。Caspae-3屬于白介素 Ib轉換酶家族成員,是細胞凋亡的執行者。Caspae酶是一種半胱氨酸蛋白激酶,與啟動凋亡和效應階段關系密切。Caspae-3是促凋亡信號轉導通路的重要效應酶,它的出現是細胞死亡的標志,Caspae-9和 Caspae-8分別啟動細胞內外凋亡通路與 Caspae-3直接相關。近年的研究表明在 IRI中活化的 Caspae-3可以裂解 Bcl-2,促使線粒體釋放 CytoC促使細胞凋亡。因此能抑制劑 Caspae-3蛋白和 Bax蛋白的表達,同時又能促使 Bcl-2蛋白表達,改善在 IRI中的作用 ,減少細胞凋亡,盡可能地保持器官的基本功能。本實驗以對缺血缺氧最敏感的海馬組織作為研究對象,可看出 Bcl-2蛋白的表達在 I/R組和 P組中都在再灌注12h時達到最高,其數值分別是(36.09±0.71)和(43.46±1.11),隨著再灌注時間的增加,表達逐步下降,但 Bcl-2蛋白表達在 P組始終高于 I/R組;Bax、Caspae-3和TUN EL在 I/R組分別在 24h、48h、和48h時達到高峰,其數值 分別是 (56.13± 1.26)、 (44.52± 0.90)和 (75.45± 2.83),以后隨再灌注的時間增加表達逐漸減少,而在 P組 Caspae-3和 Bax隨再灌注時間的延長 ,二者的表達逐步降低,顯著低于 I/R組 Caspae-3和 Bax蛋白表達;此外 TUNEL的實驗結果也進一步證明 P組的大鼠海馬 CA1區細胞凋亡程度顯著低于 I/R組;Bcl-2/Bax在 I/R組和 P組都在關注12h最高,其數值分別是0.80和2.30,以后隨灌注時間的延長逐漸降低 ,但 P組始終大于 I/R組。丙泊酚作為一種新型的麻醉兼有鎮靜最常用的藥已廣泛用于臨床上。近年研究其在腦保護方面的研究頗多。其保護機制是多位點相互作用的結果。比如其與維生素 E化學結構相似具有抗氧化,保護線粒體和清除自由基的特性;抑制中樞神經系統興奮性氨基酸的釋放[2];非選擇性抑制一氧化氮合酶的活性,降低神經系統一氧化氮含量;預防鈣超載。抑制細胞的凋亡,比如促進 Bcl-2[3]的蛋白表達,抑制 Caspase-3和 Bax蛋白表達。總之,在組織器官缺血再灌注過程中應用丙泊酚麻醉藥可減少細胞的凋亡,對其有保護作用。

[1]Pulsinelli WA,JamesBA.New model of bilateral hemispheric ischemia in the unanes the tized rat[J].Stroke,1979,10:267

[2]Snyder GL,Galdi S,Hendrick J P,et al.general anaesthetics selectively modulate glutamatergic and dopaminergic signaling via sitespecific phosphorylation in vivo[J].Neuro pharmacology,2007,53(5):619-630

[3]Chen J,Graham SH,Chen PH,et al.Bcl-2 is expression in neurons that survive focal cerebral ischemia the rat[J].Neuroreport,1995,26(2):394-396