Twist和基質(zhì)金屬蛋白酶 -2在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達分析

裴素霞,齊貴勝

研究顯示,轉(zhuǎn)錄因子 Twist、基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)-2通過不同的途徑在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等方面起著重要的作用[1-2]。本研究采用免疫組織化學法檢測乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中 Twist、MMP-2的表達,探討兩者在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌浸潤、轉(zhuǎn)移過程中的作用及其相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標本來源 聊城市人民醫(yī)院病理科存檔的 2008年 1月—2009年 12月外檢乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織標本蠟塊 68例 (患者術(shù)前均未經(jīng)放療、化療及激素治療),均為女性病例,年齡32～75歲,平均 51.04歲。患者年齡≤50歲者 31例, ＞50歲者 37例;腫塊直徑≤2 cm者 32例,2～5 cm者 20例,≥5 cm者 16例;伴有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 31例,無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者37例;根據(jù) Elson and Ellis半定量分級法進行組織學分級:Ⅰ級 23例,Ⅱ級 32例,Ⅲ級 13例。20例乳腺良性病變 (乳腺纖維腺瘤)為對照組。病理診斷經(jīng)兩位病理學專家復(fù)核證實。

1.2 試劑 Twist鼠抗人單克隆抗體為 Santa Cruz公司產(chǎn)品(工作濃度為 1:200);鼠抗人 MMP-2單克隆抗體 (即用型),免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司,操作步驟按說明書進行。

1.3 方法 所有標本均經(jīng) 10%中性甲醛溶液固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋。將每一例蠟塊作 4μm厚的連續(xù)切片,免疫組化采用 Elivision Plus法檢測標本組織中的 Twist和 MMP-2表達。用已知的陽性切片作為陽性對照,用 PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷標準 Twist、MMP-2主要表達于細胞質(zhì)中,以細胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。參照文獻 [3-4]以半定量判斷 Twist、MMP-2免疫組化結(jié)果:光鏡下隨機觀察免疫組化染色切片 5個高倍鏡視野,每個視野分別計算 200個細胞,共計數(shù) 1 000個細胞。從兩方面對其進行評分:按陽性著色程度評分,0分為無著色;1分為淺黃色;2分為棕黃色;3分為棕褐色。再按陽性細胞所占比例評分:0分為陰性;1分為 ＜10%;2分為 11% ～50%;3分為 51%～75%;4分為 ＞75%。以兩者乘積判定結(jié)果:4～l2分定為陽性,4分以下定為陰性。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 11.5軟件包進行統(tǒng)計學處理,組間比較采用 χ2檢驗;Twist、MMP-2表達的相關(guān)分析采用非參數(shù)相關(guān)性 Spearman檢驗,顯著性水準 α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Twist、MMP-2蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織和乳腺纖維腺瘤組織中的表達比較 Twist、MMP-2蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的陽性表達率為 55.88%、73.53%,明顯高于其在乳腺纖維腺瘤中陽性表達率 15%、35%,差異有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為 10.380和 10.055,P＜0.01,見表 1)。

表1 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌及乳腺纖維腺瘤組織中 Twist和MMP-2的陽性表達Table 1 The positive expression of Twist and MMP-2 in IDCand fibroadenoma

2.2 Twist、MMP-2表達水平與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌臨床病理特征的關(guān)系 腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與未轉(zhuǎn)移、不同組織學分級乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織 Twist陽性表達率和 MMP-2陽性表達率間差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);不同年齡患者、不同直徑腫瘤乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中 Twist、MMP-2陽性率間差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05,見表 2)。

表2 不同臨床病理指標乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中 Twist、MMP-2陽性率表達比較Table 2 Comparison of the positive expression rates of Twist and MMP-2 in IDCwith different clinical-pathological features

2.3 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中 Twist、MMP-2表達的相關(guān)性68例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中 Twist和 MMP-2同時陽性表達 32例,占 47.06%(32/68);Twist和 MMP-2同時陰性表達 12例,占 17.65%(12/68)。經(jīng)統(tǒng)計學 Spearman檢驗,Twist表達與 MMP-2表達呈正相關(guān) (r=0.272,P＜0.05,見表3)。

3 討論

Twist作為果蠅、鼠、人等生物體內(nèi)的一種堿性螺旋一環(huán)一螺旋轉(zhuǎn)錄因子,在胚胎生長發(fā)育階段誘導(dǎo)細胞遷移的調(diào)控過程中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn) Twist具有癌基因的特征,能編碼凋亡抑制蛋白,通過作用于 p53依賴性和非依賴性通路、N-Myc通路以及 NF-KB通路發(fā)揮抗凋亡作用[5-7],Twist還可通過對 Akt途徑的正性調(diào)控作用抑制凋亡[8];Twist在轉(zhuǎn)錄水平上通過影響 E-box啟動子的表達,誘導(dǎo)上皮細胞 -間葉細胞轉(zhuǎn)變 (EMT)的形成[9],從而抑制 E-cadherin轉(zhuǎn)錄,使由 E-cadherin所調(diào)控的細胞粘附作用失效,促進腫瘤細胞從原發(fā)灶上脫落,侵入周圍組織[10];Twist上調(diào)可增強 VEGF表達,促進血管生成,并提高染色體的不穩(wěn)定性,促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[11]。Yang等[12]用裸鼠的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌模型顯示,Twist高表達的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌細胞系易發(fā)生轉(zhuǎn)移,Twist對癌細胞的血管內(nèi)滲和肺轉(zhuǎn)移起重要作用。本實驗發(fā)現(xiàn)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中 Twist的陽性表達率為 56%,明顯高于對照組的 15%;Twist的陽性表達與患者的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分級有關(guān),發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學分級較高的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中 Twist的陽性表達率明顯增高,與蔡鳳林等[13]研究結(jié)果一致,提示 Twist參與了乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的發(fā)生、發(fā)展。

表3 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中 Twist、MMP-2表達相關(guān)性Table 3 Correlation between the expression of Twist and MMP-2 in IDC

細胞外基質(zhì)的降解和基底膜的破壞是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的先決條件,其中 MMPs與腫瘤關(guān)系最為密切。MMPs是一組依賴于鋅離子的能降解細胞外基質(zhì)的內(nèi)肽酶家族,能夠降解細胞外基質(zhì),促進腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。MMP-2是金屬蛋白酶家族中與腫瘤關(guān)系最為密切的因子之一。MMP-2是一種鋅離子依賴的蛋白水解酶,由腫瘤細胞和間質(zhì)細胞以酶原形式分泌,經(jīng)水解后激活,能特異性地降解基底膜的主要成分:Ⅳ型膠原,還可降解 V、Ⅵ、X型膠原、FN和明膠,同時通過對細胞外基質(zhì)的改建,促進腫瘤新生血管的形成,促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。Tester等[15]通過基因轉(zhuǎn)染,將 pro-MMP-2基因轉(zhuǎn)入人乳腺浸潤性導(dǎo)管癌 MDA-MB-231細胞株中,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因后的腫瘤細胞侵襲能力明顯增加。馮悅年[16]采用免疫組化 SP法檢測 65例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中 MMP-2的表達,結(jié)果顯示:MMP-2表達與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌病理學分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),而與患者年齡、腫瘤大小無關(guān),MMP-2高表達者生存率明顯降低。本實驗發(fā)現(xiàn)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中 MMP-2的陽性表達率為 74%,明顯高于對照組 35%。MMP-2的陽性表達與患者的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分級有關(guān),與患者年齡及腫瘤大小無關(guān),與文獻報道相似[17],說明 MMP-2參與了乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的浸潤和轉(zhuǎn)移,并與腫瘤的惡性程度相關(guān)。

顧紀明等[18]研究 48例結(jié)直腸癌組織中的 Twist和 MMP-2的表達,結(jié)果標明 Twist和 MMP-2的表達有關(guān)。楊靜等[19]采用 RNA干擾技術(shù)在小鼠乳腺浸潤性導(dǎo)管癌細胞株 4T1中沉默 Twist的表達,通過全基因組基因芯片技術(shù)檢測了 Twist沉默前后 4T1細胞基因表達譜的差異性,結(jié)果顯示 Timp-2(MMP2的抑制劑)被上調(diào),認為在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌發(fā)展中,Twist很可能通過調(diào)節(jié) MMP-2來降解在侵襲和轉(zhuǎn)移中遇到的一系列組織屏障從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移。本研究 68例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中 Twist和 MMP-2同時陽性表達 32例,占47.06%(32/68);Twist和 MMP-2同時陰性表達 12例,占17.65%(12/68),經(jīng)統(tǒng)計學分析 Twist表達與 MMP-2表達呈正相關(guān),提示 Twist、MMP-2共同參與了乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移,Twist可能通過上調(diào) MMP-2的表達,促進細胞外基質(zhì)降解,成為其促進乳腺浸潤性導(dǎo)管癌浸潤、轉(zhuǎn)移的因素之一。

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