利用白腐真菌處理阿維菌素廢水的研究

姚清國,杜允成,宋艷麗,趙 倩,劉顯龍

(1.石家莊學(xué)院化工學(xué)院,河北石家莊050035;2.河北欒城樓底中學(xué),河北石家莊051430)

1 引言

阿維菌素(Arem yctins簡稱AVM)是阿佛曼鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的各組分組成的混合物,是一種大環(huán)內(nèi)酯抗生素類殺蟲殺螨劑。阿維菌素作為一種新型、高效、低殘留生物農(nóng)藥,是目前中國應(yīng)用最廣泛的理想抗寄生蟲藥,其產(chǎn)量迅速增長。然而在阿維菌素的生產(chǎn)過程中,排放大量的高濃度有機(jī)廢水,主要包括生產(chǎn)過程中的排水、產(chǎn)品洗滌水、設(shè)備和車間地面的沖洗水。廢水中主要成分有可溶性蛋白類、氨基酸、殘?zhí)恰o機(jī)鹽及微量的阿維菌素,有機(jī)物濃度高、毒性大、污染物成分復(fù)雜、難生物降解物質(zhì)多、噸產(chǎn)品廢水排放量大,在生產(chǎn)過程中排放的廢水化學(xué)耗氧量(COD)等大大超出排放標(biāo)準(zhǔn)的要求,廢水中殘留的抗生素對處理廢水中的曝氣時(shí)的微生物有很大的殺傷性,因此,尋求優(yōu)良的微生物菌種進(jìn)行處理阿維菌素廢水十分必要。

白腐真菌(w hite rot fungus)是一種能夠引起木材白色腐朽的擔(dān)子菌,它腐生在木材或樹木上,使木材上出現(xiàn)袋裝、片裝或者環(huán)形的淡色海綿狀團(tuán)塊。它能夠降解其它微生物無法或很難降解的污染物。白腐真菌是木質(zhì)真菌中隊(duì)木質(zhì)素降解能力最強(qiáng)的,是已知的能在純培養(yǎng)中將木質(zhì)素徹底降解為CO2和H2O的惟一的一類生物。

白腐菌降解污染物是依靠其分泌的木質(zhì)素過氧化酶(Lip)、錳過氧化酶(M nP)和漆酶(Laccase)催化降解有機(jī)物的,其降解機(jī)理既包括生物學(xué)機(jī)制又有一般的化學(xué)物理過程,是兩者有機(jī)的結(jié)合。白腐真菌上述的特殊降解機(jī)理是其降解過程具有獨(dú)特的特點(diǎn)與優(yōu)勢。白腐真菌的生物降解的特點(diǎn)可以歸納為非專一性、非水解性和細(xì)胞外性。白腐真菌可以降解不同的化學(xué)物質(zhì),具有廣譜的底物范圍,對底物的結(jié)構(gòu)和類型的要求是高度非特異性的;非水解性是相對其他生物大分子的分解機(jī)制而言的,木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)骨架中并不存在可以水解的鍵,對酶的水解不發(fā)生通常的水解反應(yīng),由于木質(zhì)素不溶于水,而如此巨大的分子又不能進(jìn)入真菌的細(xì)胞內(nèi),所以這種生物降解只能發(fā)生在細(xì)胞外。另外白腐真菌降解木質(zhì)素的主要的酶也都是在細(xì)胞外的液體或其他物質(zhì)中分離出來的。選用白腐真菌法處理制藥廢水的關(guān)鍵技術(shù)是優(yōu)勢菌種的篩選,本文主要是研究從腐木中篩選白腐真菌菌種,希望通過測定其對阿維菌素廢水的COD廢水的去處能力來篩選出性能優(yōu)良的菌種,用于處理阿維菌素制藥廢水。

2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

主要實(shí)驗(yàn)試劑包括葡萄糖、瓊脂粉、KH2PO4、M gSO4?7H 2O和丙三醇,均為國產(chǎn)分析純。主要實(shí)驗(yàn)儀器包括電子天平、超凈工作臺、新型恒溫培養(yǎng)振蕩器、立式壓力蒸汽滅菌器、磁力加熱攪拌器和顯微鏡,均為國產(chǎn)儀器。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 分析方法

實(shí)驗(yàn)中各種指標(biāo)的測定均按國家標(biāo)準(zhǔn)方法,其中目測觀察：主要觀察白腐真菌在固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基內(nèi)的分布情況、生長活力、顏色等。用于表征白腐真菌的平板培養(yǎng)與污水處理中的生長情況。COD的測定為重鉻酸鹽法(GB11914-89)。

2.2.2 培養(yǎng)基的配制

(1)馬丁氏(Martin)瓊脂培養(yǎng)基。葡萄糖10g/L,蛋白胨 5g/L,WKH 2 PO4 1g/L,M gSO4?7H 2O 0.5g/L,瓊脂20g/L,pH值自然即可,121℃滅菌20m in,制成平板,冷卻后備用。馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基作為白腐真菌的分離培養(yǎng)基。

(2)PDA液體培養(yǎng)基。取去皮馬鈴薯200g,切成拇指大小的塊狀,加水1 000m L,電爐加熱,攪拌,煮沸30min,用3層紗布將馬鈴薯過濾取其濾液,將濾液補(bǔ)足至1 000m L,加葡萄糖20g,KH2 PO4 3g,MgSO4?7H2O 1.5g,一般 pH 值不用調(diào)節(jié),自然達(dá)到4.5左右,溶化后分裝,121℃滅菌20min,制成平板,冷卻后備用。平板PDA固體培養(yǎng)基用于菌種的擴(kuò)培。

(3)PDA液體培養(yǎng)基。取去皮馬鈴薯200g,切成拇指大小的塊狀,加水1 000m L,電爐加熱,攪拌,煮沸30min,用3層紗布將馬鈴薯過濾取其濾液,將濾液補(bǔ)足至1 000m L,加葡萄糖20g,KH2PO43g,MgSO4?7H 2O 1.5g,一般 pH 值不用調(diào)節(jié),自然達(dá)到4.5左右,121℃滅菌20min,冷卻后備用。PDA固體培養(yǎng)基用于菌種的擴(kuò)培及后續(xù)處理污水。

2.2.3 白腐真菌的分離

將從石家莊郊外采集腐朽的樹木刮去外表皮后,用無菌水沖洗干凈,切成玉米粒大小的塊狀,經(jīng)過紫外消毒,把剪好的材料置于75%乙醇中消毒1m in,而后用無菌水沖洗2～3次,接入已倒好的馬丁氏瓊脂平板培養(yǎng)基上,對木塊進(jìn)行編號。將培養(yǎng)皿置于27℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～7d,然后放入冰箱保存。

2.2.4 白腐真菌的純化

取切口處新長出的菌絲,及時(shí)轉(zhuǎn)接至新鮮PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。待菌落出現(xiàn)后,根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異以及長出時(shí)間的不同,分別挑取各平板上的菌落邊緣的菌絲接于新鮮PDA液體培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)。培養(yǎng)數(shù)日后,觀察菌落的形態(tài),并作相應(yīng)的記錄(包括影象記錄)。將相對應(yīng)的菌株轉(zhuǎn)至PDA液體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)2d后,觀察它們的生長情況(12h 1次),若發(fā)現(xiàn)不純的菌株,從菌落邊緣挑取菌絲接入新的PDA液體培養(yǎng)基。純化菌株編號后,再轉(zhuǎn)至PDA液體培養(yǎng)基上,于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7d,然后放入冰箱保存。

2.2.5 白腐真菌的鑒定

菌落形態(tài)采用肉眼觀察法;菌體形態(tài)采用光學(xué)顯微鏡觀察。并依據(jù)《真菌鑒定手冊》,參照其中的內(nèi)容進(jìn)行。

2.2.6 白腐真菌的保藏

將純化的白腐真菌PDA液體培養(yǎng)基用磁力攪拌器攪拌,制成懸浮液,選擇離心管,每管裝0.5m L白腐真菌培養(yǎng)基懸浮液,再分別加入濃度為0.5m ol/L的丙三醇溶液 0.5m L,搖晃,混勻,然后放入4℃的冰箱中保藏。

2.2.7 白腐真菌處理廢水

在6個(gè)250m L三角瓶中依次加入50m L廢水,并標(biāo)號,再分別相對應(yīng)加入標(biāo)號為1～6號的白腐真菌懸浮液5m L,于震蕩培養(yǎng)箱中37℃,轉(zhuǎn)速為150r/min震蕩反應(yīng),于72h取水樣測定COD。

2.3 結(jié)果與討論

2.3.1 白腐真菌的分離結(jié)果

將從石家莊郊外采集腐朽的樹木,處理了60個(gè)木塊,每個(gè)平板內(nèi)培養(yǎng)6個(gè)木塊,板內(nèi)木塊培養(yǎng)3天、6天的形態(tài)如圖1,圖2所示。腐朽的木塊經(jīng)過6d的培養(yǎng),選取木塊生長最快的平板,木塊底部呈現(xiàn)淡褐紅色,木塊表面布滿淡色菌絲,生長旺盛,菌絲發(fā)干。依據(jù)《真菌鑒定手冊》鑒定為白腐真菌。

圖1 培養(yǎng)3d的木塊

圖2 培養(yǎng)6d的木塊

2.3.2 白腐真菌的處理阿維菌素廢水

按照2.2.4的方法,用PDA液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。白腐真菌在液體表面生長,2d后菌絲體交結(jié)成厚度約為1mm的菌絲膜覆蓋在液體培養(yǎng)基表面;在液體搖床震蕩培養(yǎng)中,3d內(nèi)白腐真菌萌發(fā)的菌絲在搖動作用下自發(fā)的纏繞成菌絲球。培養(yǎng)5d后,1～6號三角瓶內(nèi)的白腐真菌生長形態(tài)大致一致,菌液呈淡黃色,菌絲聚集成球狀,菌絲球直徑約2～5mm,其具體差別為1、6號菌液比較渾濁,菌球大小不均勻;而2、3、4、5號菌液顏色較淺較澄清,菌球大小均勻。

2.3.3 污水處理后的結(jié)果

按照2.2.6的方法處理污水后,白腐真菌及污水的具體狀況如表1。

表1 白腐真菌及污水處理后的狀況

根據(jù)重鉻酸鹽法測阿維菌素廢水原液及經(jīng)過1～6號白腐真菌處理的廢水的COD值,具體情況如表2。

表2 廢水COD的測定結(jié)果

由表2可以看出,根據(jù)廢水COD值的測定結(jié)果,2號白腐真菌處理廢水的效果最好,3、4、5號處理效果僅次于2號,1、6號處理效果則略顯一般。雖然最終處理結(jié)果沒有達(dá)到國家廢水排放標(biāo)準(zhǔn),但是此次實(shí)驗(yàn)為后續(xù)研究白腐真菌處理廢水的實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù),并打下了一定的基礎(chǔ)。

4 結(jié)語

本文以白腐真菌的分離、純化及生物降解阿維菌素廢水的應(yīng)用為主要研究對象,研究了白腐真菌分離、純化的條件及對阿維菌素污水的降解能力。得到以下主要結(jié)論。

(1)馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基中腐朽的木塊經(jīng)過5～7d的平板培養(yǎng)后呈絨毛狀,菌絲布滿木塊表面。

(2)在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)白腐真菌時(shí),震蕩培養(yǎng)加快白腐真菌的生長速度。

(3)各菌株之間存在著一定的差異,這與菌種的不同特性有關(guān)。

(4)白腐真菌可以降解阿維菌素廢水,使阿維菌素廢水的COD值在一定程度上可以降低,另外,廢水的降解效果是與生長特性基本成正相關(guān)。

從應(yīng)用前景來說,白腐真菌生物降解污染物的發(fā)展?jié)摿艽蟆Ｅc傳統(tǒng)的物理化學(xué)和生物修復(fù)方法相比,白腐真菌生物處理技術(shù)具有處理污染物范圍廣,操作設(shè)備簡單,成本低廉,對低濃度污染物講解效果好,降解徹底無二次污染的優(yōu)點(diǎn)。因此研究和應(yīng)用白腐真菌生物技術(shù)具有廣闊的前景。

[1]梁 峙,張 凱.白腐真菌菌絲生長的物理化學(xué)條件研究[J].信陽師范學(xué)院學(xué)報(bào),2009,22(1)：66～70.

[2]董金霞,許 偉.白腐真菌處理阿維菌素廢水優(yōu)勢菌種篩選研究[J].河北化工,2006,29(10)：60～ 62.

[3]黨鳳霞,羅人明.白腐真菌降解阿維菌素廢水的實(shí)驗(yàn)研究[J].污染防治技術(shù),2006(19)：17～18.

[4]姚 瑤,田文艷.簡述阿維菌素廢水處理現(xiàn)狀[J].黑龍江科技信息,2010(6)：56.

[5]趙 華,齊 剛,代 彥.白腐菌液體深層培養(yǎng)條件的研究[J].生物技術(shù),2003,24(4)：41～47.

[6]閆松林,周從植.白腐真菌處理廢水的影響因素及發(fā)展趨勢[J].水處理技術(shù),2002,18(2)：306～307.

[7]李 望,韓文質(zhì).對污染物有獨(dú)特降解作用的白腐真菌[J].生物學(xué)通報(bào),1997,32(12)：9～ 12.

[8]李慧蓉.白腐真菌生物學(xué)和生物技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[9]何德文,肖羽堂,周申范.白腐真菌處理難生物降解的有機(jī)廢水研究[J].工業(yè)水處理,2000,20(3)：16～18.

[10]高大文,文湘華,錢易.白腐真菌培養(yǎng)條件對其分泌木質(zhì)素降解酶的影響[J].中國環(huán)境科學(xué),2005,25(5)：572～575.

[11]陳元彩,龍世明.高濃度阿維菌素生產(chǎn)廢水治理與資源回收技術(shù)研究[J].重慶環(huán)境科學(xué),1999,21(1)：40～43.

[12]閆松林,周從植.白腐真菌處理廢水的影響因素及發(fā)展趨勢[J].水處理技術(shù),2002,18(2)：306～ 307.

[13]林 剛,文湘華,錢 易.應(yīng)用白腐真菌技術(shù)處理難降解有機(jī)物的研究進(jìn)展[J].環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備,2001,2(4)：1～8.

[14]魏景超.真菌鑒定手冊(第 1版)[M].上海：科學(xué)技術(shù)出版社,1979.

[15]國家環(huán)保局《水和廢水監(jiān)測分析方法》編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法[M].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社,1998：40.

[16]Kenneth E H amm el.Ex tracellular free radical biochem istry ofligninolytic fungi[J].New Jou rnal of Chem istry,1996,20(2)：195～ 198.

[17]Niole M,Chamberland H,Geiger JP,et al.Immunocy tochem ical locaization of laccase L1 in wood decayed by Rigidoponuslignosus[J].Appl Environ M icrobiol,1992(58)：1 727～ 1 739.