不同處理方法對馬鈴薯莖尖成苗率的影響

于仙萍，陳 煒，卞春松，金黎平*

（1.寧夏涇源縣農業技術推廣服務中心，寧夏 涇源 756400；2.中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

馬鈴薯脫毒技術的應用與推廣，解決了長期以來困擾馬鈴薯生產中的病毒性退化問題，據統計馬鈴薯脫毒種薯增產效果顯著，一般增產幅度可達30%～50%[1]。馬鈴薯莖尖剝離技術是獲得脫毒種薯目前最直接、最有效的途徑，但是馬鈴薯塊莖通過莖尖剝離后，有些病毒不能一次脫除，要對試管苗進行再次莖尖剝離，在此項技術中，馬鈴薯莖尖成苗率高低是莖尖剝離技術的關鍵。對馬鈴薯試管苗進行熱處理和病毒唑處理，結合莖尖培養可達到較高的脫毒率，但就其對莖尖成苗率影響方面的研究較少。本試驗旨在對帶病毒的馬鈴薯試管苗進行熱處理和病毒唑處理，再剝離莖尖進行組織培養，研究不同處理方法對馬鈴薯莖尖成苗率的影響，為獲得較多數量的脫毒馬鈴薯苗提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2009年3～6月在中國農業科學院蔬菜花卉研究所馬鈴薯課題組的實驗室進行。試驗材料為中國農科院蔬菜花卉研究所育成的品系，代號為N88和D575。經 ELISA檢測，N88帶有PVY和PLRV病毒，D575帶PVS病毒。

1.2 試驗方法

1.2.1 熱處理+莖尖剝離

本試驗采用鈍化病毒的熱處理方法對試驗材料N 88試管苗進行不同時間段的變溫處理。熱處理設計為40℃/25℃（4 h/20 h）的變溫，時間段分為2、3、4周，變溫處理后進行莖尖剝離，每個處理剝離60個莖尖，統計不同處理不同培養時間段的莖尖成苗率。

1.2.2 病毒唑處理+莖尖剝離

試驗材料N88、D575的試管苗分別接種在普通MS培養基和加入20 mg·L－1、30 mg·L－1病毒唑的MS培養基中，培養40 d后莖尖剝離。每個處理剝離60個莖尖，統計不同處理的莖尖成苗率。

1.3 莖尖剝離及組織培養

1.3.1 莖尖剝離

經過不同處理的試管苗莖尖，在30～40倍解剖鏡下進行分生組織剝離，切取長度為0.1～0.3 mm帶有1～2個葉原基的莖尖，立即接種到莖尖培養基的試管中。

1.3.2 莖尖培養

莖尖培養基為MS+0.05 mg·L－1NAA+0.1 mg·L－16－BA+0.1 mg·L－1GA3+4 g·L－1瓊脂粉+30 g·L－1白砂糖的改良固體培養基，莖尖分生組織在20～23℃，1 800～2 000 lx光照強度，每天16 h光照下誘導培養。30 d后開始調查成苗率，每隔10 d調查1次，直到60 d。

成活莖尖長出帶有兩個以上葉片的小植株記做成苗，成苗率=成苗株數／成活莖尖個數（莖尖分生組織發育為可見綠點謂之成活）。

2 結果與分析

2.1 熱處理對莖尖成苗率的影響

通過對試驗的觀察記載，熱處理對試管苗影響很大，37℃恒溫處理2周后試管苗基本枯死，所以帶馬鈴薯病毒的試管苗一般不能進行37℃以上的恒溫處理。試管苗40℃/25℃（4h/20h）變溫處理時間的長短對剝離莖尖的成苗率有較大影響，隨著處理時間加長，莖尖也受到損傷。4周變溫處理后試管苗枯死50%以上，剝離莖尖成苗率也隨之降低。

從表1可以看出，不同熱處理時間對莖尖成苗率影響較大，其中不進行熱處理和2周變溫熱處理剝離莖尖成苗率較高，兩者數據很接近，30 d后調查莖尖成苗率分別為26.7%和23.3%，60 d成苗率分別為 61.7%和60.0%；4周變溫處理后剝離莖尖成苗率最低，莖尖分生組織培養30 d和40 d均不能成苗，50 d成苗率僅為5.0%，60 d為15.0%。

表1 不同熱處理對N88莖尖成苗率的影響(%)Table 1 Plantlet regeneration percentage of shoot tip culture of the clone N88 after the heat treatment of alternating temperature 40℃/25℃(4h/20 h)

2.2 病毒唑處理對莖尖成苗率的影響

從表2可以看出，N88材料不經過病毒唑處理直接莖尖剝離，成苗率最高，60 d成苗率達到61.7%；經過不同濃度病毒唑處理的莖尖成苗率在各時間段都很接近，30 d均為5.0%，而60 d為40%和41.7%。D575材料不同濃度病毒唑處理對莖尖成苗率影響較大，未經病毒唑處理的莖尖成苗率最低，60 d僅為20%；20 mg·L－1病毒唑處理40 d后莖尖剝離成苗率很高，為63.3%，30 d成苗率為56.7%，60 d達到83.3%。

表2 不同濃度病毒唑處理對莖尖成苗率的影響Table 2 Influence of various levels of virazole on plantlet regeneration percentage of shoot tip culture

3 討論

病毒唑處理后，剝離莖尖能獲得較高的莖尖成苗率，是由于病毒唑處理過程中對試管苗培養影響小，莖尖沒有受到損傷。對于試驗材料D575經過20 mg·L－1病毒唑處理40 d后的莖尖成苗率明顯高于對照，有待進一步的試驗研究。試驗材料不同，病毒唑處理后剝離莖尖成苗率有一定的差異，材料D575在不同的培養階段莖尖成苗率都高于材料N88。近年來，更多的研究是將某些病毒抑制劑加入培養基中，以提高莖尖脫毒效果。

同一材料不同的處理方法對莖尖成苗率的影響較大，材料N88經過不同濃度病毒唑處理剝離莖尖成苗率低于2周熱處理，但相對于3、4周變溫處理的莖尖成苗率有明顯的提高。

不同處理剝離莖尖成苗后經ELISA檢測，材料N88對照（0周）莖尖剝離PVY脫毒率為60%，PLRV脫毒率為70%，同時脫除PVY、PLRV的概率為30%；N88經過2周變溫處理后莖尖剝離PVY、PLRV的脫毒率均為93.3%，而同時脫除PVY、PLRV的概率為86.6%；N88經過3、4周變溫處理的剝離莖尖PVY、PLRV脫毒率為100%。N88材料在加入 20 mg·L－1、30 mg·L－1病毒唑的培養基中培養40 d后莖尖剝離，PVY、PLRV的脫毒率為100%；D575材料經過20 mg·L－1、30 mg·L－1的病毒唑處理后莖尖剝離，PVS的脫毒率均為40%，而沒有經過病毒唑處理直接莖尖剝離PVS脫毒率為0。Wambugu等[2]在培養基中加入20 mg·L－1病毒唑，經5個月培養的 3～4 mm長的莖尖，使Norchip品種脫除了89%PVY、90%PVS，說明帶毒試管苗在加入病毒唑培養基中培養后再進行莖尖剝離可以提高PVY脫毒率，本試驗PVY病毒的脫毒效果與Wambugu等的試驗結果相接近，病毒唑對馬鈴薯其它病毒的影響情況需進一步的試驗研究。

[1]馬力.黑龍江省西部馬鈴薯脫毒、快繁、保種新技術[J].中國馬鈴薯,2009,23(1):44－45.

[2]Wambugu F M,Seeor G A,Gudmestad N C.Eradiction of potato virus Y and S from potato by chemotherapy of cultured axillary bud tips[J].American Potato Journal,1985,62:667－672.