過氧草酸酯－四溴熒光素化學發光法測定多巴胺

謝俊霞，馬曉梅，韓繼紅，姚東云，張靜

（1.河北化工醫藥職業技術學院 制藥系，河北 石家莊 050026；2.河北大學附屬醫院 神經內科，河北 保定 071002）

過氧草酸酯類化學發光（PO－CL）是一類以多氯代水楊酸酯與草酰氯反應生成的草酸酯、過氧化氫和熒光劑以及一些增強發光效率的催化劑為主要組成的化學發光體系［1－2］.草酸酯中雙（2，4，5－三氯苯基）草酸酯（TCPO）和雙（2，4－二硝基苯基）草酸酯（DNPO）最為常用，TCPO 較DNPO 更為穩定，但反應活性低，通常需要一些增強發光效率的堿性催化劑，已報道的催化劑有水楊酸鈉、三乙胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、咪唑等［1，3－4］，其中咪唑與TCPO 聯合使用被認為是最有效的試劑.本文對過氧化草酸酯的多種催化劑和熒光試劑分別進行了比較，發現一種新的催化劑檸檬酸鈉，建立了檸檬酸鈉催化的過氧草酸酯－四溴熒光素－過氧化氫化學發光體系，該體系可用于兒茶酚胺類物質多巴胺的測定.

多巴胺是下丘腦和腦垂體腺中的一種關鍵神經元物質，中樞神經系統中多巴胺的濃度則直接影響人們的情緒，多巴胺大劑量使用時有正性肌力作用，收縮血管的作用明顯，可使血壓升高.其測定方法的研究對神經生理學研究、疾病診斷以及相關藥物的質量控制都具有重要意義，檢測這類微量神經遞質及其代謝產物對研究這類遞質的生理機能和有關的疾病診斷尤為重要［5］.

目前測定鹽酸多巴胺的方法主要有分光光度法、毛細管電泳法、高效液相色譜法、電化學分析法及化學發光法.液相色譜分離－電化學檢測是目前生物樣品中多巴胺測定最有效的方法.但化學發光分析由于其靈敏度高、方法簡便而在多巴胺的檢測中也得到了廣泛的應用［6］，多巴胺化學發光測定體系也已有多篇報道，這些不同的體系可分為以下幾類：1）基于多巴胺參與化學發光反應并作為發光體.利用高錳酸鉀－鹽酸多巴胺體系［7］、二氯熒光素增敏的兒茶酚胺－次氯酸［8］等體系可實現多巴胺的測定.2）利用多巴胺對魯米諾－KIO4化學發光體系［9－10］的增敏作用進行測定.3）利用多巴胺的化學發光抑制作用.基于在堿性介質中，鹽酸多巴胺對魯米諾－鐵氰化鉀［11－13］、魯米諾－次氯酸［14－15］、Fe（Ⅱ）－光澤精［16］化學發光反應體系的強烈抑制作用，建立了反相流動注射抑制化學發光測定鹽酸多巴胺的新方法，多巴胺抑制電化學發光［17－18］的定量測定技術也已經建立.4）多巴胺在堿性介質催化劑作用下將多酚轉化產生過氧化氫，通過異魯米諾－過氧化物酶發光體系測定過氧化氫從而間接測定多巴胺［19－21］.

基于堿性介質中在咪唑的催化作用下多巴胺可轉化為過氧化氫的性質，將建立的過氧草酸酯發光新體系用于針劑中多巴胺的測定，方法簡便，為多巴胺的測定提供了一種靈敏檢測技術.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超微弱靜態化學發光測定儀（中科院生物物理所）；UV－2401PC紫外可見分光光度計（日本島津公司）.

1.0×10－3mol／L 雙（2，4，6－三氯苯基）草酸酯（bis（2，4，6－trichlorophenyl）oxalate，TCPO）乙腈溶液，1.0×10－3mol／L 羅丹明B（Rhodamine B，RB），1.0×10－3mol／L 四溴熒光素（Tetrabromofluorescein，TBF），檸檬酸三鈉，咪唑，十二烷基硫酸鈉（SDS），十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），吐溫－80，過氧化氫（30%質量分數）.

1.2 實驗方法

樣品預處理：一定體積的咪唑溶液（50 mmol／L，pH＝10.0 NH3H2O－NH4Cl緩沖溶液）及10μL 53nmol／L多巴胺或樣品溶液60 ℃水中反應30min.

化學發光信號的測定：適當濃度的過氧化氫溶液、催化劑及熒光試劑各50μL 混合，注入1.0×10－3mol／L TCPO 溶液50μL，記錄發光信號強度.

2 結果與討論

2.1 試劑注入順序的考察

過氧化氫、催化劑、熒光試劑及發光試劑TCPO 以不同次序放入發光反應管中，對發光信號影響明顯，經過對幾種試劑不同的混合及注入順序比選，其中以過氧化氫、催化劑、熒光試劑首先混合，然后注入TCPO信號強度明顯最大.實驗中選用該順序.

2.2 不同催化劑的影響

PO－CL體系中常使用堿性催化劑，水楊酸鈉、咪唑在文獻中有較多報道［1，3］，實驗中分別以水楊酸鈉、檸檬酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、四硼酸鈉、咪唑為催化劑，與不加任何催化劑進行對照，發光信號強度結果見圖1.除加入四硼酸鈉使發光信號略有下降，其他試劑均可有效地提高信號強度.其中以檸檬酸三鈉效果最為顯著.

圖1 不同催化劑的影響Fig.1 Effect of catalyzer on the chemiluminescence intensity

催化劑不僅改變發光強度，發光峰形也有明顯改變，如圖2所示，加入咪唑和檸檬酸鈉催化劑后均使TCPO 體系瞬間發光，峰形尖銳，而檸檬酸鈉作為催化劑時峰信號強度是加入常用的咪唑催化劑的3.2倍.

2.3 催化劑濃度的選擇

1.0mol／L H2O2、1.0×10－5mol／L 熒光試劑與不同濃度檸檬酸鈉或咪唑催化劑各50μL 混合，注入50μL 1.0×10－3mol／L TCPO，對催化劑的濃度進行了考察，結果見圖3.由圖3可知，使用咪唑作為催化劑，發光信號隨其濃度的增加而增強，但咪唑濃度過高會降低發光強度；使用檸檬酸鈉作催化劑，實驗范圍內發光信號隨催化劑濃度而增加，但濃度較大時，信號增加速度較為緩慢.檸檬酸鈉溶解時速度較慢，后繼實驗中選用0.1mol／L檸檬酸鈉作為催化劑.

由圖3還可以看出，四溴熒光素作為熒光試劑，其化學發光強度高于羅丹明，測定中使用TBF.

圖2 不同催化劑存在下化學發光信號Fig.2 Chemiluminescence profiles of in presence of different catalysis

圖3 檸檬酸鈉及咪唑催化劑濃度的影響Fig.3 Effect of concentration of catalyzer on the chemiluminescence intensity

2.4 四溴熒光素濃度的影響

1.0mol／L過氧化氫、0.1mol／L檸檬酸鈉與不同濃度的TBF各50μL混合后，按1.2中實驗方法測定化學發光信號，結果見圖4.發光信號隨TBF 濃度的增加而顯著提高，而且相對標準偏差呈減小趨勢.濃度高于5.0×10－5mol／L后信號增加變緩.

圖4 四溴熒光素濃度的影響Fig.4 Effect of concentration of TBF on the chemiluminescence intensity

2.5 表面活性劑的影響

以檸檬酸鈉為催化劑，與1.0mol／L H2O2和熒光試劑混合，并分別加入50μL 20g／L陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）；陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）季銨化物和非離子表面活性劑吐溫－80，考察表面活性劑對PO－CL體系的影響.各種表面活性劑對發光信號未見顯著改善，因此，后繼實驗中未加任何表面活性劑.

2.6 方法的工作曲線、精密度、檢出限、干擾實驗及多巴胺注射液的測定

以咪唑為催化劑，在咪唑存在下對多巴胺的轉化為過氧化氫的反應溫度、pH 等反應條件進行了詳細地探討和優化，本實驗參考優化后的反應條件，在pH＝10.0咪唑溶液（50mmol／L）中加入10μL 不同濃度的多巴胺或樣品溶液60 ℃水中反應30 min.反應液冷卻至室溫后用本實驗建立的檸檬酸鈉催化的TCPOTBF測定.

結果表明，化學發光強度與多巴胺濃度成線性，一元回歸方程為：ICL＝22.95＋0.21c，相關系數R＝0.996 9.在2.01～1.00×10－3nmol／L多巴胺濃度內呈線性.

以500nmol／L多巴胺進行11次重復測定，相對標準偏差為10.98%，根據IUPAC的規定，計算得該方法測定多巴胺時3倍標準偏差檢出限為1.40nmol／L.

對鹽酸多巴胺注射液中共存的成分乙二胺四乙酸二鈉、亞硫酸氫鈉進行測定，對發光信號在10%誤差范圍內均不存在干擾.

利用上述建立的以檸檬酸鈉為催化劑的過氧草酸酯－四溴熒光素方法測定了3個批號的鹽酸多巴胺注射液中多巴胺含量，測定結果見表1.

表1 鹽酸多巴胺含量測定結果Tab.1 Determination results of dopamine

2.7 可能的發光機理探討

多巴胺在堿性咪唑介質中苯環上的羥基轉化為過氧化氫［22］，二芳基草酸酯和過氧化氫可發生化學反應，生成一種雙氧基中間體儲能物，該中間體不穩定，在分解過程中將能量傳遞給熒光物質，熒光劑在發生化學反應條件下分子結構保持不變，其作用是轉移化學能和發射熒光［5］，這些發光反應過程見圖5.

圖5 多巴胺化學發光測定的反應機理Fig.5 Possible reaction mechanism of CL determination of dopamine

3 結論

建立了以檸檬酸鈉為催化劑的過氧化草酸酯－四溴熒光素化學發光新體系，該體系用于多巴胺的測定，直接測定濃度為2～1 000nmol／L，操作簡便、靈敏快速，準確度高，可直接用于注射液中多巴胺含量的檢測.

［1］ EMTEBORG M，PONTEN E，IRGUM K.Influence of imidazole and bis（trichlorophenyl）oxalate in the oxalyldiimidazole peroxyoxalate chemiluminescence reaction［J］.Analytical Chemistry，1997，69（11）：2109－2114.

［2］ RYU K，YUJI K，JIRO M，et al.Unprecedented chemiluminescence behaviour during peroxyoxalate chemiluminescence of oxalates with fluorescent or electron－donating aryloxy groups［J］.Luminescence，2006，21（3）：164－173.

［3］ JUANA C，MANUEL S，DOLORES P.Improved peroxyoxalate chemiluminescence－based determinations by use of continuous reagent addition to remove background emission［J］.Analytical Chemistry，1994，66（22）：4079－4084.

［4］ ALVAREZ F J，PAREKH N J，MATUSEWSKI B，et al.Multiple intermediates generate fluorophore－derived light in the oxalate／peroxide chemiluminescence system［J］.Journal of the American Chemical Society，1986，108（20）：6435－6437.

［5］ 勾凌燕，劉景東，王憬，等.固相萃取－高效液相色譜電化學法檢測大鼠血漿兒茶酚胺［J］.分析試驗室，2006，25（1）：90－94.GOU Lingyan，LIU Jingdong，WANG Jing，et al.Determination of catecholamines in rat plasma by oasis HLB solid phase extraction and high－performance liquid chromatography with electrochemical detection［J］.Chinese Journal of Analysis Laboratory，2006，25（1）：90－94.

［6］ ORAWON C，PASSAPOL N，ALONGKORN Y，et al.Recent electrochemical and optical sensors in flow－based analysis［J］.Sensors，2006，6（10）：1383－1410.

［7］ 李麗清，孟兆珂，呂九如.流動注射化學發光法測定多巴胺［J］.泰山醫學院學報，1998；19（2）：115－117.LI Liqing，MENG Zhaoke，LüJiuru.Determination of dopamine by flowinjection analysis with chemiluminescence de－tection［J］.Journal of Taishan Medical College，1998，19（2）：115－117.

［8］ ELZBIETA W，URSZULA N，ANATOL KOJLO.Flow－injection chemiluminescence determination of catecholamines［J］.Instrum Sci Technol，2007，35（2）：219－231.

［9］ 于春玲，唐玉海，韓小年.流動注射化學發光法測定制劑和血漿中的鹽酸多巴胺［J］.分析測試學報，2006，25（1）：119－121.YU Chunling，TANG Yuhai，HAN Xiaonian.Determination of dopamine hydrochloride in pharmaceutical samples and blood plasma by flow inject ion chemiluminescence method［J］.Journal of Instrumental Analysis，2006，25（1）：119－121.

［10］ 杜凌云，王術皓，林世蕾.流動注射協同化學發光法測定鹽酸多巴胺［J］.分析試驗室，2005，24（7）：88－90.DU Lingyun，WANG Shuhao，LIN Shilei.Flow injection chemiluminescence method for determination of dopamine hydrochloride［J］.Chinese Journal of Analysis Laboratory，2005，24（7）：88－90.

［11］ EDYTA N，ROSA B R，ANATOL K.Determination of dopamine by flow－injection analysis coupled with luminolhexacyanoferrate（Ⅲ）chemiluminescence detection［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2004，36（1）：219－223.

［12］ 王術皓，杜凌云，魏新庭，等.反相流動注射－化學發光法測定鹽酸多巴胺［J］.光譜學與光譜分析，2005，25（5）：678－680.WANG Shuhao，DU Lingyun，WEI Xinting，et al.Determination of dopamine hydrochloride by a reverse flow injection chemiluminescence method［J］.Spectroscopy and Spectral Analysis，2005，25（5）：678－680.

［13］ WANG Shuhao，DU Lingyun，WANG Liangyu，et al.Flow injection with inhibited chemiluminescence method for the determination of dopamine hydrochloride［J］.Analytical Sciences，2004，20（2）：315－317.

［14］ ZHANG Chengxiao，HUANG Jiachu，ZHANG Zhujun，et al.Flow injection chemiluminescence determination of catecholamines with electrogenerated hypochlorite［J］.Analytica Chimica Acta，1998，374（1）：105－110.

［15］ SUN Yuanyuan，TANG Yuhai，ZHEN Xiaohui，et al.Determination of catecholamines by flow injection chemiluminescence method based on their restraining effects on the luminol－potassium chlorate system［J］.Analytical Letters，2004，37（12）：2445－2458.

［16］ ZHANG Lihe，TESHIMA N，HASEBE T，et al.Flow－injection determination of trace amounts of dopamine by chemiluminescence detection［J］.Talanta，1999，50（3）：677－683.

［17］ LI Feng，PANG Yongqiang，LIN Xiangqin，et al.Determination of noradrenaline and dopamine in pharmaceutical injection samples by inhibition flow injection electrochemiluminescence of ruthenium complexes［J］.Talanta，2003，59（3）：627－636.

［18］ ZHU Liande，LI Yingxiu，ZHU Guoyi.Flow injection determination of dopamine based on inhibited electrochemiluminescence of luminol［J］.Analytical Letters，2002，35（15）：2527－2537.

［19］ ARAKAWA H，KANEMITSU M，MAEDA M.Chemiluminescent assay for catecholamines by the generation of hydrogen peroxide in basic solution and the use of isoluminol－microperoxidase［J］.Analytical Sciences，1999，15（12）：1269－1272.

［20］ LI Baoxin，ZHANG Zhujun，JIN Yan.Plant tissue－based chemiluminescence flow biosensor for determination of unbound dopamine in rabbit blood with on－line microdialysis sampling［J］.Biosens.Bioelectron，2002，17（6－7）：585－589.

［21］ OSAMU N，TOSHINAO I，HIROYUKI M，et al.Chemiluminescent detection of catecholamines by generation of hydrogen peroxide with imidazole［J］.Luminescence，1999，14（3）：123－127.

［22］ LU T T，YOUNJOO P，LIR W F，et al.Increased dopamine D2receptor binding and enhanced apomorphine－induced locomotor activity inμ－opioid receptor knockout mice［J］.Brain Research Bulletin，2003；61（1）：109－115.