豬瘟診斷方法的研究進展

葉 芬，蔡家利

（1.西南大學動物科技學院，重慶 400700；2.重慶理工大學藥學與生物工程學院,重慶 400050）

1 豬瘟病毒的分類、形態與結構

豬瘟隸屬于黃病毒科、瘟病毒屬成員，病毒粒子略呈圓形，具有脂蛋白囊膜，粒子直徑為34～50nm，從電鏡照片觀察，可見病毒粒子表面有脆弱的纖突結構，病毒核衣殼呈二十面體對稱，內部核心直徑約為30nm。病毒在蔗糖密度梯度中的浮密度是1.15～1.16g/cm3，等電點是4.8。在脂蛋白囊膜上，存在著病毒基因組編碼的囊膜糖蛋白E0（也被稱為ERMS）、E1和E2，組成核衣殼蛋白的C蛋白與病毒基因組相連，以維持核酸的穩定性。

2 豬瘟診斷方法研究進展

2.1 豬瘟實驗室常規診斷技術

2.1.1 免疫熒光試驗 免疫熒光試驗（FAT）是豬瘟的常用診斷方法。豬瘟熒光抗體染色技術是將提純后的抗CSFV抗體IgG標記上熒光物質，制成豬瘟熒光抗體染色試劑。用該試劑去著染豬病料（如病豬扁桃體、淋巴結、腎等）的冰凍切片或觸片，然后利用熒光顯微鏡觀察組織細胞內是否有亮綠色熒光。如果被觀察的組織細胞內有亮綠色熒光，就是豬瘟病毒熒光抗體染色陽性，說明被檢病料中有CSFV感染。反之，被觀察的組織細胞內沒有亮綠色熒光，就是豬瘟病毒抗體染色陰性。

利用熒光抗體技術檢測病豬內臟器官可能存在的CSFV，對CSF的早期診斷具有十分重要的意義。豬瘟熒光抗體染色技術在CSFV感染早期檢出率較高，不僅能檢出強毒抗原，還能檢出低毒力病毒感染的帶毒母豬，豬瘟的常規診斷需要4～5 d，而該項技術可在12h內作出判斷，既快速又客觀、準確，在規模化豬場臨床上得到了廣泛應用。所以目前許多規模化大豬場利用熒光抗體染色技術，有計劃地對豬場進行豬瘟凈化。

Robert son等首次將FA運用于豬瘟病料和組織培養物的檢測。張淑霞等從抗豬瘟高免血清中提取IgG，標記熒光素（FITC），制備出了豬瘟熒光抗體（CSFV-FA）。該抗體能夠檢測人工感染豬扁桃體中的病毒抗原，而且這種熒光反應能夠被抗CSF高免血清特異性抑制。應用CSFV-FA可在病死豬的扁桃體、脾、腎、回腸末端等器官的觸片或冰凍組織切片中發現病毒抗原，也可先將可疑病料經無菌處理后接種于細胞培養物，隨后再用CSFV-FA檢測出感染細胞中的豬瘟病毒抗原。FAT法簡單、快速、可靠，許多國家將它作為執行豬瘟消滅計劃的法定診斷試驗。

2.1.2 酶聯免疫吸附試驗 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）具有高度敏感性和特異性，而且它的試劑比較穩定，操作簡單且無放射性危害，特別是商品試劑盒和自動化儀器的應用，使其成為一種適用于各級檢驗部門的免疫標記技術。隨著檢驗醫學的不斷發展，酶聯免疫測定的技術方法也得到發展和更新，Dot-ELISA、發光酶聯免疫測定、免疫印跡法、BAS-酶聯免疫吸附試驗等方法都不斷得到應用。

周宗元等應用豬瘟兔化弱毒PEG沉淀抗原和HRP-SPA建立了HRP-SPA-ELISA檢測CSFV抗體的方法，通過對5份陰性血清和32頭仔豬注射疫苗前后不同時期的256份血清進行檢測，證明本法有較高的敏感性和特異性。余興龍等以在大腸桿菌中高效表達的CSFV的E2基因產物為抗原，以HRP標記的的兔抗豬IgG為二抗，建立了檢測CSFV抗體的間接ELISA方法，結果表明用E2基因產物蛋白作為診斷豬瘟的抗原，具有特異性高、易純化和成本低等特點。陸芹章等（2004）制備了豬瘟單克隆抗體，以ACI-ELISA法檢測CSFV，并用PCR方法作比較，結果表明30份豬瘟陰、陽性病料的ACI-ELISA試驗結果與PCR檢測結果相符，本方法與動物接種、免疫熒光、血清中和等CSF常規診斷方法比較，更加快速、準確、經濟，且一次可檢測大量樣品，同時比PCR方法耗時短、費用低，便于推廣。陳振海（2005）等以CSFV GST-Erns融合蛋白作抗原進行間接ELISA，結果表明用該方法檢測CSFV抗體具有很高的特異性和敏感性。

目前，已有很多采用基于中和性單抗的競爭ELISA方法來檢測某些病原中和抗體的報道，說明利用CSFV中和性單抗作為競爭抗體檢測CSFV中和抗體是可行的。梁冰冰等利用桿狀病毒表達豬瘟病毒（CSFV），以重組E2蛋白作為包被抗原，辣根過氧化物酶標記的E2蛋白中和性單克隆抗體作為競爭抗體，建立了一種用于檢測CSFV中和抗體的重組E2蛋白競爭抑制ELISA（CI-ELISA）方法，該法操作簡便、快速，適于現場應用，同時具有一般ELISA的操作優點，可以用于大量現場樣品的檢測和流行病學監測。

2.2 分子生物學診斷方法

2.2.1 常規反轉錄-聚合酶鏈反應 聚合酶鏈反應（PCR）技術的建立帶動了分子生物學的飛速發展，應用反轉錄-聚合酶鏈反應技術（RT-PCR）成功測定了多株CSFV的全基因序列，為豬瘟的致病機理、免疫機制、檢測防控提供了堅實的基礎。因為在臨床檢測中要經常檢測RNA病毒，而通常所用的PCR試劑盒是DNA聚合酶，不能以RNA為模板直接擴增，故在進行PCR前，先將病毒RNA逆轉錄為 cDNA，所以建立了RT-PCR技術。隨著人們對CSFV分子生物學研究的深入，尤其是對CSFV Alfort株和 Bresica株基因組全序列的成功測定，使得RT-PCR技術在CSFV的研究中被廣泛應用。RT-PCR作為檢測CSFV的一種方法，其特異性強、靈敏度高、重復性好，操作也很簡單，整個過程在1 d內即可完成，能達到快速檢測的目的，并且適合于各種含毒材料的檢測，也可用于臨床。此外，RT-PCR技術還可區別與CSFV相關的病毒，如BVDV，以及能引起和CSF相似臨床癥狀的豬病病毒，如亞洲CSFV、偽狂犬病病毒，其靈敏度可達100%。

2.2.2 實時熒光定量PCR技術 熒光定量PCR技術是近年來發展起來的一種核酸定量技術，因其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確等優點成為核酸檢測中的重要工具。它是在常規PCR引物之外加入一個兩端帶有熒光標記的寡核苷酸探針。該技術的研究也逐漸成為豬瘟診斷方法研究的方向。由于實時定量熒光PCR儀可以同時檢測多種熒光，因此可以進行多重檢測，即在同一個反應體系中，將不同探針標記上不同的熒光基團，這樣就可以同時檢測多種疾病的病原，這也是疫病診斷的一個研究方向。Risatti等（2003，2005）建立了一種實時熒光定量RT-PCR方法檢測CSFV，并與病毒分離作了比較，證明其敏感性高于病毒分離（100%/72.4%），特異性略低于病毒分離（98.9%/100%）。日本學者Ophuis等（2006）應用熒光定量RTPCR方法對攻毒豬各組織臟器中的病毒進行了檢測，結果發現早在攻毒后1 d就在扁桃體中檢測到了病毒的存在。Cho等應用不同熒光基團標記的兩條TaqMan-MG探針建立了一種能鑒別韓國CSFV野毒株和LOM疫苗株的熒光RT-PCR方法。

2.2.3 核酸探針技術 核酸探針技術是在分子標記的基礎上，以病毒RNA基因組為模板制備探針，在cDNA合成之后，進行Southern blot，特異的核酸探針會在不同病毒基因組cDNA上產生特異的條帶。此方法具有特異性強、準確可靠的優點，但診斷費用較高。此法可用于不同毒株的分離和鑒定。Cruciere等、Dable等、Colijn等利用 CSFV基因組 RNA構建cDNA，與BVDV進行序列分析和比較，合成了6個探針，按照它們在病毒基因組的位置，根據特異的雜交條帶可以區別CSFV、BVDV和BDV。我國趙啟祖等研制了石門血毒P80核酸探針，可對病毒RNA進行定量檢測，靈敏度達220 pg。核酸探針技術有特異性強、準確可靠的優點，但需要合成核酸探針，診斷費用較高。

2.2.4 基因芯片檢測技術 基因芯片是近年來分子生物學與微電子學等多學科交叉融合而成的一項高新技術，在基因表達譜、功能基因組、疾病基因診斷等基礎研究及臨床應用中已經顯示出重要的理論意義和廣泛的應用前景。它被譽為又一次生命科學領域的革命，世界各國爭相投入研究。

基因芯片是指在一個很小的表面，通常是硅化玻璃，覆蓋上成千上萬的寡核苷酸，每一個固定在芯片上的特定位置都可以找到這個點，每個寡核苷酸反應芯片上有成千上萬的拷貝互補信息，包括cDNA芯片、寡核苷酸芯片、基因組芯片，主要目標是用于DNA序列的測定、病原檢測、基因表達譜鑒定、基因突變體的檢測分析，以及基因組的功能研究等。基因芯片技術為動物疾病診斷提供了新的技術理念，出現可以替代傳統方法的新技術，并形成新產品。目前，我國也正在研究應用基因芯片檢測技術來診斷豬瘟，這將對我國豬瘟的防控具有深遠意義。

3 結語

我國現階段CSF流行形勢復雜，沒有明顯規律性，CSF仍是我國動物疫病防制的一大難題，防控任務艱巨。在目前已有的檢測手段中，分子生物學方法高度靈敏特異，且檢測迅速，十分適合大面積檢測，有著不可替代的優勢。分子標記疫苗一旦成熟，血清學方法就能夠進行鑒別診斷，ELISA方法也具有廣闊前景。基因芯片診斷技術是一種高效、靈敏和特異性好的診斷技術，在不久的將來將會廣泛應用于豬瘟診斷。

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