秋水仙素在園藝植物多倍體育種中的應用研究進展

趙陽 黃韜

（遼寧省大連市農業(yè)科學研究院 116036）

采用染色體加倍的方法選育作物新品種的途徑稱為多倍體育種。園藝植物的多倍體育種可以高效率改變園藝植物的某些性狀，如利用無性繁殖避免因基因重組分離改變品質、通過多倍體的巨大性提高產量、對非種子食用器官的瓜果進行三倍體無籽植株的獲得來增加商業(yè)價值等，說明多倍體育種在園藝植物育種中具有重要作用。本文就近年來有關秋水仙素對植物進行多倍體誘導的文獻報道進行了綜合概述。

1 多倍體育種在園藝植物中的應用

多倍體是高等植物染色體進化的顯著特征。據統(tǒng)計，高等植物中的多倍體占65%以上，如小麥、煙草、棉花、馬鈴薯、甘蔗等都是自然形成的多倍體。在被子植物中約50%是多倍體、豆類植物18%是多倍體。自1937年Blackeslee和Avery利用秋水仙素誘導蔓陀蘿四倍體獲得成功后，已在1000多個植物種中獲得了人工多倍體。常見的多倍體果樹有三倍體蘋果、多倍體柑橘、三倍體梨、多倍體葡萄、四倍體金絲小棗、多倍體獼猴桃等。三倍體和四倍體的蔬菜有西瓜、白菜、甜瓜、馬鈴薯、茼蒿、黃花菜、辣椒、甘藍型油菜、黃瓜、番茄、不結球白菜、花椰菜、芹菜、蘿卜、萵苣、菠菜、絲瓜、石刁柏、生姜、茄子、蘆筍等；花卉中常見的有四倍體金魚草、四倍體麝香百合及多倍體的庫拉索蘆薈、藥用百合、菊花腦、君子蘭、花葉綠蘿等。

1.1 多倍體育種在果樹上的應用

利用多倍體可孕性低來獲得無籽或少籽果實。果樹可以進行無性繁殖，經過多倍體誘導后植株產生的多倍體效應可以被穩(wěn)定的利用，獲得三倍體無籽果實以改良果實的品質。

1.2 多倍體育種在蔬菜上的應用

在蔬菜的多倍體育種應用上最為著名的是三倍體無籽西瓜，三倍體西瓜無籽的特點被廣泛地應用于西瓜育種方面。多倍體的巨大性在蔬菜上也表現(xiàn)顯著，對以營養(yǎng)體為商品部分的蔬菜作物來說，由細胞染色體加倍帶來的性狀變化是有利的。

1.3 多倍體育種在花卉上的應用

花器作為花卉的主要觀賞部位，通過多倍體育種的方法可育成1批具有較高觀賞價值的花卉品種。人工誘導后的花卉品種多具有巨大性、可繁性低、適應性強、光合速率高等優(yōu)勢。

2 秋水仙素加倍法的應用

秋水仙素是微管特異性藥物，由于適宜濃度的秋水仙素能破壞紡錘絲的形成，因此可使分生細胞復制的染色體在細胞分裂時不能分向兩極，從而導致新生細胞的染色體加倍。

2.1 秋水仙素的處理方法

多倍體除了自然發(fā)生外，也可以通過人工方式誘導。常見的方式是物理和化學方式。物理方式有溫度激變、機械創(chuàng)傷、電離輻射等。化學誘導以N-亞硝基-二甲脲和秋水仙素效果最好。

2.1.1 實體人工加倍處理法 普遍采用的方法有注射法、涂抹法、浸種法及包埋法。在君子蘭、菊花腦、油菜等植株上運用浸種法誘導出了多倍體，其缺陷表現(xiàn)在有效誘導效率低、毒害大、缺氧致死等方面；在成齡桑上用注射法誘導成功四倍體植株，其缺陷表現(xiàn)在針頭易刺傷生長點，造成生長點腐爛死亡，誘導率低；對甜菊采用涂抹法誘導多倍體植株，雖可避免機械損傷，但藥劑與生長點難以完全接觸；在生姜上使用脫脂棉包埋生長點法進行多倍體誘導則克服了以上許多問題。

2.1.2 離體培養(yǎng)加倍法 隨著組織培養(yǎng)技術的發(fā)展，染色體加倍可以在離體組織培養(yǎng)條件下利用秋水仙素誘導單個體細胞染色體加倍，獲得多倍體再生。這一方法可以克服常規(guī)人工加倍處理方法的缺陷，容易控制實驗條件，減少或避免倍性嵌合體。離體材料一般是愈傷組織、莖尖、莖段、根尖組織、胚狀體或用子房、原生質體。離體條件下染色體加倍的途徑有：（1）先用秋水仙素溶液處理培養(yǎng)材料，然后轉入分化培養(yǎng)基；（2）在含秋水仙素的離體培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時間，誘導加倍，再轉入分化培養(yǎng)基。陳新民等使用胚培養(yǎng)后加倍和浸根加倍處理兩種方法都獲得了較明顯的加倍效果。利用組織培養(yǎng)的方法我國已獲得了蘋果、葡萄、蘆筍、百合、大蒜、西瓜等園藝植物的多倍體材料。

2.2 秋水仙素的濃度和處理時間

秋水仙素的濃度和處理時間是影響染色體加倍的最重要的外在條件。用秋水仙素水溶液處理外植體時，關于濃度和處理時間的最適宜組合問題尚有不同看法。染色體加倍的原理是化學藥物能夠破壞、阻止紡錘絲的形成。沒有紡錘絲參與，染色體復制和分裂雖然正常，但分裂開來的單體卻因分裂而加了倍。由于這種加倍原理，導致了不同植物在不同濃度及處理時間產生的效果不同，有些學者認為低濃度長時間的組合較好，但還有些學者則傾向于高濃度短時間的組合。由于不同來源的外植體對秋水仙素的反應、耐受能力及敏感程度不同導致不同作物有其適當?shù)慕M合性。在對蒔菜加倍時，適宜的秋水仙素濃度為100mg/L，處理時間為10～14d；生姜的染色體加倍適宜濃度為30mg/L，處理時間5d；小麥產生小麥單倍體的染色體加倍適宜濃度為500mg/L，處理時間為24h；菊花腦染色體加倍適宜濃度為50mg/L，處理時間為48h；葡萄染色體加倍適宜濃度0.4%～0.6%，處理時間48～72h；葡萄二倍體玫瑰香品種進行四倍體誘導的適宜濃度為0.2%，處理時間45h；嘎拉蘋果的染色體加倍適宜濃度為0.5%，處理時間為96h；藍莓的染色體加倍適宜濃度為0.025%，處理時間24～48h；甜椒花藥染色體加倍適宜濃度為0.1%～0.2%；草莓莖尖染色體加倍的適宜濃度為200～400mg/L，處理時間為 20～30d；馬鈴薯染色體加倍適宜濃度為0.2%～0.3%，處理時間 12～48h；西瓜染色體加倍適宜濃度0.05%；黃花菜的染色體加倍，用0.05%濃度的棉花對帶芽狀突起的球狀體進行覆蓋，并將其轉移到0.02%～0.05%的固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)效果最佳；獼猴桃染色體加倍的適宜濃度為200mg/L，處理時間為7d；小葉綠蘿同源多倍體誘導適宜濃度為0.05%，處理時間3d；苧麻多倍體育種適宜濃度0.1%～0.25%,處理時間12～24h；堅尼草的染色體加倍適宜濃度為0.1%，對種子的處理時間為4h；皇家嘎拉蘋果多倍體誘導的適宜濃度為25mg/L，處理時間為5d；蘆筍的多倍體誘導適宜濃度為0.1%，處理時間為12h；菠菜種子染色體加倍濃度為0.4%，處理時間為12h；黃瓜干種子多倍體誘導的適宜濃度為0.35%，處理時間為48h；辣椒幼苗滴心處理進行染色體加倍適宜濃度為0.2%，處理時間7d；茼蒿染色體加倍時滴苗處理適宜濃度為0.1%～0.2%，處理時間為48h；藥用百合叢生芽進行染色體加倍誘導的適宜濃度為0.1%，處理時間72h；庫拉索蘆薈對試管苗的多倍體誘導適宜濃度為0.06%，處理時間12h，對莖段、葉片進行覆棉處理的適宜0.02%，處理時間48h。

秋水仙素處理的濃度和時間因處理對象的不同而異，材料質密溶液滲透慢時，應適當延長處理時間。據報道秋水仙素濃度在0.01%～1.0%內都是有效的，最常用的濃度為0.2%，在對某一植物作初次誘導試驗時，一般采用高濃度短時間的處理方法。對于園藝植物來說，果樹和觀賞樹木多用較高濃度（1.0%～1.5%）,而草本的蔬菜和花卉則應用較低濃度（0.01%～0.2%）。

3 多倍體的鑒定方法

經過秋水仙素處理以后，有些材料的染色體加倍，有些未發(fā)生加倍，還有些為嵌合體。而因其加倍效果的鑒定是倍性操作的重要一步。目前的鑒定方法主要有以下幾種。

3.1 形態(tài)鑒定法

植物體細胞染色體加倍后，分化生成多倍體植株，一般表現(xiàn)為巨大性。通常莖變粗短，葉片變厚，有時比較粗糙或生皺紋，多毛，花朵、果實和種子變大，生育期延長，整個植株變成巨型，這些特征都可作為判別多倍體的依據。

3.2 氣孔鑒定法

根據氣孔保衛(wèi)細胞中的葉綠體數(shù)目、單位面積的氣孔數(shù)目、氣孔的長度和寬度鑒定多倍體。應以葉綠體數(shù)目和氣孔密度為主，用氣孔大小作為參考。

3.3 花粉粒鑒定法

根據花粉粒的大小及不同花粉數(shù)目可鑒定倍性，一般四倍體的花粉比二倍體大1倍；通過觀察比較再生植株花蕾與花的大小、花粉形成與結角等形態(tài)特征可鑒別二倍體與單倍體。

3.4 染色體數(shù)目鑒定法

盡管早期可以通過上述3種方法初步鑒別出多倍體，但要斷定為多倍體還要進行進一步的鑒定，多采用植物組織培養(yǎng)物的染色體制片技術進行染色體計數(shù)，該法是到目前為止最為直觀準確的鑒定方法。現(xiàn)在已有報道，通過細胞光度儀來測定單個細胞的DNA含量，然后根據DNA含量比較來推斷細胞的倍性水平。如Owen通過流式細胞儀分析馬鈴薯單元單倍體和多倍體DNA含量，Nokamura用普通光學顯微鏡分析四倍體葉面與二倍體葉面的相對含量；Wan對玉米的誘導結果進行鑒定分析。

4 前景展望

在今后的植物多倍體誘導育種中，尤其是當某一親本具有不利的細胞質基因時，利用該法通過調整親本的倍性，對克服遠緣雜交不孕性、遠緣雜交的不實性、創(chuàng)造遠緣雜交育種的中間親本及培育作物新品種等方面仍有積極的作用。因多倍體的產生受外植體的生長狀態(tài)、倍性水平以及秋水仙素的處理時間、濃度、溫度和滲透劑的影響。要使秋水仙素誘導多倍體成為一項成熟的技術，還需在更多植物上開展廣泛的研究。尤其是外植體的生長狀態(tài)，對加倍效果的影響機理有待于進一步的研究。