蔬菜雄性不育基因工程

張文英 陳紹莉

（遼寧省農業技術學校 110161）

雜種優勢育種已成為許多蔬菜的主要育種方法。其中，選育雄性不育系及其恢復系是關鍵。通過基因工程的手段創造雄性不育系和恢復系可以克服常規育種手段的局限性，較之利用自然變異、遠緣雜交和引種等選育手段具有更廣闊的前景。近幾年，我國在番茄、大白菜、甘藍等蔬菜上利用基因手段獲得雄性不育系方面的研究取得了較大進展。

1 基因工程雄性不育的機制

1.1 花粉發育的分子生物學研究

從植物發育分子生物學的角度來看，植物發育的各個階段是植物基因工程時空調控表達的結果。在花粉發育過程中，減數分裂后或者小孢子有絲分裂后有大量的基因被激活，例如：番茄中的Lat 51和Lat 52等，這些花粉特異基因的啟動子可以應用在雄性不育基因工程中，從而達到雄性不育和恢復可育的目的。除了花粉特異基因外，絨氈層特異表達基因也備受重視。目前，絨氈層特異的轉錄活動及其特異的遺傳序列方面的探討取得了初步進展，并且已經從不同植物中分離出一些絨氈層特異基因的cDNA 克隆，如番茄中的 108，127a，92b，油菜 A9 部分在花藥和花粉中特異表達。

1.2 花藥或花粉特異表達啟動子的克隆

轉基因雄性不育及其恢復的一個關鍵是花藥或花粉特異表達啟動子，花藥或花粉特異表達啟動子可以直接驅動人工雄性不育基因在花粉或花藥內特異表達，而對雌蕊和其它器官沒有影響。目前已先后分離克隆和測序了 TA29、ZM13、A9、S1、Wosg6B等花藥或花粉特異表達啟動子的克隆及表達時空的分析，為創造轉基因雄性不育奠定了基礎。

2 基因工程雄性不育的方法

2.1 借助編碼細胞毒素基因的特異表達

將花粉或花藥特異表達啟動子、細胞毒素基因以及轉錄終止子3部分組裝構建成嵌合基因并轉化，細胞毒素的特異表達能夠選擇性的破壞與花粉發育相關的某些器官或組織，阻斷其發育過程，導致植物雄性不育。

Mariani等把TA29與Barnase基因相連，構建了嵌合基因TA292Barnase，以農桿菌法轉化到煙草和油菜，得到了轉基因植株。進一步研究發現，轉Barnase基因在絨氈層細胞中特異表達，專一性的破壞絨氈層的發育，導致花粉敗育，而除了花粉敗育外，轉基因植株在其它方面都是正常的。目前，利用基因工程創造雄性不育主要采用上述方法。B lock等利用玉米的絨氈層特異啟動子pca55和水稻的絨氈層特異啟動子pE1和pT72與Barnase基因嵌合后轉化小麥獲得雄性不育植株。有人將一個編碼核糖體失活蛋白 （RIP）的cDNA序列置于TA29啟動子控制之下導入煙草，在21株轉化株中20株表現雄性不育。我國學者在這方面也取得了很大進展。李勝國等通過融合TA29和Barnase以及TA29和Barstar構建了人工雄性不育基因和恢復基因，轉化煙草后獲得了雄性不育植株。Zhan等利用水稻花粉啟動子psl和Barnase基因，轉化在煙草中獲得了雄性不育植株。凌定厚利用psl2Barnase載體獲得了水稻的轉基因雄性不育植株。周雪榮等將構建好的嵌合基因TA292barnase轉化油菜，得到的轉化株是完全雄性不育的，對花藥進行組織切片分析，證明轉化的barnase基因破壞了絨氈層細胞，最終導致花粉發育不良和雄性不育。鐘蓉、羅玉英等和彭仁旺分別將TA292Barnase雄性不育基因導入甘藍型油菜和煙草中，轉化植株表現為雄蕊退化，花絲短于柱頭，花粉萌發率極低。劉大文等利用玉米花粉啟動子Zm13和Barnase基因構建了雄性不育基因，并用基因槍法轉化玉米，獲得了結實的轉基因植株。目前，已有大量的植物花粉花藥基因的特異啟動子被鑒定和測序，它們與任何細胞毒素基因相連均可以培養工程不育株。不過，從目前來看，Barnase基因仍是用于培育基因工程雄性不育的最佳細胞毒素基因。

2.2 利用反義RNA技術

通過反義RNA技術阻斷與花粉發育相關的基因的表達同樣可以獲得雄性不育株。類黃酮是花粉發育過程中的重要物質，苯基乙烯酮（CHS）是其合成的關鍵酶。

VanderMeer將花藥盒序列與CaMV35S啟動子串聯，使其在花藥中表達，然后將CHS基因的反義RNA基因與之串聯構建成嵌合基因導入矮牽牛，實現了CHS反義RNA基因在矮牽牛花藥絨氈層中的表達，抑制了CHS的合成，阻礙了花粉的發育，得到了雄性不育的矮牽牛植株。Kitashiba等將反義alter-native oxidase與TA29相連構成嵌合基因轉化煙草，造成轉基因煙草部分花粉敗育。Schoenbeck等將反義NADH2GOGAT基因與AAT22啟動子構建成嵌合基因轉化到苜蓿，發現在苜蓿根瘤和花中的NADH谷氨酸合成活性下降，最終得到了雄性不育的轉基因苜蓿。我國學者利用此技術成功的創造了番茄、煙草等轉基因雄性不育植株。李艷紅等構建了反義肌動蛋白基因和花藥特異啟動子TA29組成的嵌合基因，通過農桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法途徑將該基因轉化到小麥中，有60%的轉化株為完全雄性不育，在煙草和番茄中也得到了類似的結果。李祥等利用TA29啟動子與HSP70反義cDNA構建融合基因并轉化到煙草中，創造了雄性不育植株。

2.3 提早降解胼胝質

在花粉發育過程中，小孢子的分離要靠花藥絨氈層分泌胼胝質酶降解堅硬的胼胝質。這個過程有著嚴格的時間性，如果提前分泌胼胝質酶，過早降解胼胝質，小孢子發育就會停止，產生畸形花粉粒，導致植物雄性不育。

Worrall等將經過修飾的B21，32葡聚糖酶基因與擬南芥絨氈層特異表達的啟動子A3和A9重組，使轉基因植株在減數分裂時期表達過量的B21，32葡聚糖酶，從而出現了不同程度的雄性不育現象。Tsuchiya等把從大豆中分離出來的B21,32葡聚糖和從水稻中分離出來的Osg6B啟動子構建成嵌合基因轉化煙草，轉基因植株大多數花粉缺乏萌發孔，花粉集聚，花粉粒上附著胼胝，四分體時的花粉缺乏細胞壁，從而導致在四分體開始階段胼胝質降解，進而形成不同程度的雄性不育。

2.4 利用線粒體相關基因

在高等植物中存在的胞質雄性不育與線粒體的顯性突變有關，即線粒體機能損傷會導致花粉敗育。其中，RNA編輯與細胞質雄性不育有密切的關系。

Hernould等在小麥的雜合細胞質不育系中發現Atp9轉錄物的編輯率比可育親本的編輯率低。這可能是RNA的非正常編輯影響ATP的合成，從而降低花粉形成所需要的ATP水平，導致雄性不育。他們利用來自小麥的非編輯的Atp9線粒體基因誘導，獲得了雄性不育轉基因植株。Zabaleta等通過表達Atp9的反義RNA，將由非編輯的Atp9基因誘導的雄性不育轉基因植物恢復為雄性可育的植物。由于非編輯的Atp9的轉錄水平急劇下降，使花器官正常發育并產生種子，這也說明非編輯的Atp9基因表達可以誘導雄性不育，并可通過反義技術使其恢復育性。Hernould等在Atp9基因或其cDNA前，分別連接上酵母的輸導肽編碼區后，插入含CaMV35S啟動子和CaMV基因工程終止子的雙元表達載體中，轉化煙草，在獲得的轉Atp9基因植株中出現半不育、全不育等類型的雄性不育株。He等將來自大豆的與細胞質雄性不育相關的線粒體DNA序列ORF239轉入煙草核基因組中，轉基因煙草表現為半不育或雄性不育。易平等首次證明HL型細胞質雄性不育與線粒體Atp6轉錄本的編輯有一定的相關性，編輯不充分的轉錄產物最終會干擾線粒體功能的正常發揮。

2.5 導入與細胞質雄性不育相關的基因

許多研究者發現不育與可育胞質線粒體不同。一些不育細胞質特有的質粒往往被認為與細胞質雄性不育有關，如：水稻紅蓮型不育系中的m3和orfH79等。把這些質粒分離出來，將其中與細胞質雄性不育有關的片段重新構建新的嵌合基因，再導入可育的植株中，可導致雄性不育。Orf224基因是在油菜Polima胞質中發現的一個與CMS相關的mtDNA基因，王永飛等已經將其克隆到pBI121載體上，構建了其植物表達載體pBRORF，欲通過農桿菌介導法和基因槍法將Orf224轉入到油菜等十字花科作物的優良品種，可望獲得新的CMS材料。

2.6 細菌基因在植物中組成型表達

農桿菌RhizogenesA4是植物的病原物，Schmulling等將其T2DNA間的rolc基因與CaMV35S啟動子串聯成嵌合基因轉化煙草，由于rolc的系統表達，使得植株在形態上發生了一系列的變化，株高下降、頂端優勢減弱、葉片色素水平下降及雄性不育。除此之外，rolc的轉基因馬鈴薯和擬南芥也同樣表現為雄性不育，而Spena等將Rolb基因與金魚草tap1啟動子融合后，不但使轉基因植物雄性不育，還導致花藥中IAA含量增加，GA含量下降，這類基因有可能通過破壞花粉細胞中的激素平衡引起花粉敗育。

2.7 通過共抑制創造雄性不育

這一現象首先發現于矮牽牛中的CHS基因因同源序列的共抑制而導致花藥和花色的改變。目前，通過共抑制導致雄性不育和干擾花的發育過程已進行了不少的研究。Taylor等觀察到轉查爾酮合酶基因的矮牽牛植株產生的畸形花藥缺少黃酮類色素。我國學者利用此技術成功的創造了番茄、煙草的雄性不育。

2.8 雙重轉基因系雜交

這種方法是先把未來的母本分別導入兩個不同的基因，其中一個是指導反式激活蛋白多聚酶表達的花藥特異啟動子，另一個是與反義RNA或多肽鏈連鎖的反式激活蛋白的目標序列，這兩個基因單獨對雄性育性均沒有影響，但通過雜交使他們結合到一起時，后代就會100%不育。用其做母本與未轉基因的父本雜交，F1雜種中有75%的可育株。但是，這個途徑需要人工去雄雜交，限制了其應用范圍，只有那些去雄容易、繁殖系數高、有好的經濟效益的蔬菜才可能利用。

2.9 其他方法

藤曉月等發現雄性不育性不育系與保持系花藥中肌動蛋白的含量存在著顯著差異。閻隆飛等將反義豌豆肌動蛋白基因與花粉P花藥特異啟動子連接轉化小麥和番茄，得到了花藥畸形和花粉無活力的植株。Tadege研究在有氧條件下，在丙酮酸脫羧酶和乙酰脫氫酶的作用下，植物體內產生了大量的乙醛，乙醛在花粉中大量的積聚，從而造成了玉米花粉的不育。Goetz等從煙草中克隆了Nin88及其啟動子，將其啟動子與反義Nin88相連轉入植物，26%的轉基因植物表現為敗育，而其它74%的植株表現為種子數目減少。但是，這種基于擾亂植物正常生理代謝的基因操作所得到的植物雄性不育，常伴隨著生命力下降、花期延遲、植株矮小等不良性狀。此外，利用這種方法獲得的雄性不育植株還有許多困難要克服。

3 蔬菜雄性不育基因工程

自從通過基因工程創造雄性不育的方法問世以來，已經在許多作物上獲得了成功。在蔬菜育種方面，雄性不育基因工程的研究和應用起步較晚，到目前成功報道的僅有番茄、白菜等作物。我國在這方面的研究也取得了很大的進步。張宏、閻隆飛在番茄方面、余沛濤在大白菜方面以及沈革志、朱玉英在甘藍方面的研究都獲得了一定成就。

基因工程創造雄性不育技術結合傳統的與現代育種，縮短了育種年限，并已經在蔬菜上取得了成功。我們相信隨著研究的深入和生物技術的不斷完善和發展，利用基因工程創造蔬菜雄性不育系的方法會更加簡便、快速和有效，將雜種優勢的利用領域引向更高的水平。