酶聯免疫吸附試驗在藥殘檢測中的不足及解決方法

郭淑萍，徐周喬

（深圳市鹽田區動物衛生監督所，廣東深圳 518081）

食品安全問題已經成為全球關注的焦點問題之一。近年來,獸藥殘留致使食物中毒的報道屢見報端,嚴重損害了人們的健康，而且造成了意想不到的經濟損失和巨大的政治影響。傳統的檢測方法主要采用高壓液相色譜（HPLC）、氣相色譜一質譜法（GC－MS）等分析法檢測獸藥殘留，需要昂貴的儀器設備和專業人員，費時、費力、成本高，難以在基層推廣。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）具有操作簡便、靈敏度高、樣品容量大、儀器化程度和分析成本低的優點，已成為目前畜產品藥物殘留檢測中使用最普遍的方法之一，幾乎所有重要的畜產品藥殘檢測都已建立或試圖建立ELISA，如“瘦肉精”、萊克多巴胺、磺胺類、沙丁胺醇等。盡管酶聯免疫吸附試驗有操作簡便的優點，但在實踐中很容易出現各種各樣的問題，影響因素較多，易出現假陽性結果等缺點?，F將常出現問題的可能原因和解決方法以及影響因素作如下探討。

一、酶聯免疫吸附試驗原理

ELISA方法的基本原理是酶分子與抗體或抗體分子共價結合，此種結合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。此種酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發生特異性結合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現顏色反應。因此，可通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應可通過ELISA檢測儀進行定量測定，這樣就將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。

二、常出現問題的可能原因及解決方法

目前酶聯免疫法檢測用試劑盒種類繁多，有國外進口的，有國內自行研制生產的，如鹽酸克侖特羅的檢測用試劑盒就有德國拜爾、美國IDS、英國朗道、北京望爾、杭州迪恩等。如何在眾多的品牌中選擇既能滿足檢測要求又價格低廉的試劑盒是一個問題。在實際檢測中可以根據最低檢測限、回收率、交叉反應率。標準曲線圖譜及數據，進行選擇。一般進口試劑盒性能穩定性比國內試劑盒好。但不管進口或者國內試劑盒難免會造成假陰性或假陽性，常出現問題的可能原因及解決方法有其共性。

1.顯色結束仍沒有顏色或吸光度值偏低。出現這種情況的可能的原因主要有幾個方面，一是試劑盒保存運輸不當；二是使用前酶標板已完全干燥；三是酶標抗原未加或稀釋度過低或加錯；四是溫度過低或試劑盒沒有回溫；五是檢測試劑盒中的酶標抗原失效；六是試劑盒超過有效期。

解決方法：試劑盒在運轉過程中，要放在加冰袋的保溫盒中，盡量縮短運輸時間，實驗室保存試劑盒放在4℃～8℃冰箱中存放，不可放在室內。使用前檢查酶標板，將已干孔丟棄；酶標抗原必須嚴格按照說明書中酶標抗原的稀釋倍數進行稀釋并準確加樣；酶標抗原失效可與供應商聯系，進行更換；在接收試劑時要驗明有效期，如試劑盒有效期太短，不能在有效期內用完則要求供貨商換貨。

2.顯色結束整塊板吸光度值都很高。出現這種情況有兩方面原因，一是酶標抗原污染了盒內的其他試劑，二是未進行洗版操作，直接加顯色劑。此種情況可以更換新批號試劑盒，并嚴格按照說明書中的洗板操作步驟進行稀釋。

3.標準曲線形態不好，吸光度值偏高。主要是酶標抗原的稀釋倍數偏低，反應溫度過高?？乖♂寱r必須按照說明書稀釋倍數進行稀釋，反應溫度在控制合理范圍內。

4.標準曲線形態不好，吸光度值偏低。主要是因為加酶標抗原前未進行洗板操作，酶標抗原的稀釋倍數偏高，反應溫度過低。同樣要嚴格按照洗版步驟和抗原稀釋倍數操作，控制反應溫度。

5.平行性不好。主要是加樣及試劑量不準確，洗版后孔干燥時間過長，酶標抗原加入時有誤差。要求定期校準移液器，移液器與移液頭要配套，使其吻合緊密，確保準確加入足量標本和試劑。操作時務必保持實驗的連貫性，試驗的保溫溫度、時間要一致，洗滌要徹底，不要手工洗板與洗板機洗板互換。酶標抗原稀釋前注意混合均勻，使用多道移液器進行加入操作。

6.樣品的高陽性率。主要是樣品處理去脂肪或蛋白不徹底，實驗時樣品要按要求進行前處理。

7.樣品的吸光度值高于零標準孔。引起的因素主要是樣品中蛋白或脂肪含量、pH值、離子強度等。如果嚴格按照操作方法進行操作，此現象應作為陰性處理。

8.回收率不理想。如果樣品渾濁，添加標準時濃度低，添加體積大都會造成回收率不理想。做添加回收實驗時要選感覺明亮的本底，添加少量高濃度標準品。

9.整板均不顯色。整板均不顯色，包括陽性對照孔也不顯色。有下列3種情況。

（1）制造商工藝流程出現問題，如包被過程中抗原或抗體未固相化在載體上。

（2）試劑盒保存不當，或運輸過程中溫度過高，使酶蛋白變性，失去生物活性。

（3）更常見的原因是，試劑配制有誤，或操作不當所致。如終止液誤當洗滌液稀釋后當洗滌液使用，終止液誤作底物配制液配制底物。操作過程中，未加酶標抗體或抗原和未加顯色液而誤認為已加入。

對整板均不顯色，首先應核實是何種原因引起。要求配制試劑時仔細認真，嚴格按照說明書進行操作。此問題是可以完全避免的。

10.整板均顯色。出現整板均顯色的實驗室結果，主要有以下幾種原因。

（1）水質被重金屬離子污染。

（2）洗滌不充分，殘留酶標抗原或抗體，或樣品中存在其他干擾成分，未被洗掉。

（3）酶標抗原或抗體加量過多，使按規程洗滌仍達不到洗滌目的。

（4）移液頭重復使用而未清洗干凈。解決上述問題的措施是，使用新鮮蒸餾水或去離子水配制試劑；試驗前校準移液器，準確加入酶標抗原或抗體的量；充分洗滌，不使酶標記物由于洗滌不充分而殘留；移液頭盡可能一次性使用，否則就要對其徹底清洗后再用。另外，對整板均顯色要特別注意二點，一是雖然整板均顯色，但陽性對照孔比平時顯色更深；二是陽性對照孔本應不顯色而顯色，這對查找整板均顯色的原因很有幫助。

三、實驗室影響因素

除在實驗過程出現的問題，實驗室整個環境過程都會影響到檢驗結果，主要有以下幾個因素。

1.實驗室操作人員的素質因素。實驗室人員應具備一個良好的思想素質，有一定文化素質和技術素質，能熟練掌握本專業的基本理論和基本技術，認真學習新理論新知識，努力提高自己的業務水平，創造一個能夠勝任本職工作的技術平臺。在工作中，有條不紊、冷靜沉著的處理有關事務。

2.樣本處理因素。實驗室人員收到樣本后應認真查對，對不符合檢測要求的要退回，合格標本要及時進行處理檢測。對不能及時檢測的標本要妥善保存于4℃冰箱，貼好待檢標簽，做好記錄。從冰箱取出的標本要預溫至室溫，對冰凍的樣品要融化好，并充分混勻再用。

3.操作過程的影響因素。

（1）操作前應對實驗的物理參數有充分的了解，如環境溫度(保持在18℃～25℃)、反應孵育溫度和孵育時間、洗滌的次數等，要先查看水育箱溫度，是否符合要求。

（2）正確使用加樣器。加樣器應垂直加入標本或試劑，避免刮擦包被板底部。加樣過程中避免液體外濺，殘留在反應孔壁上，加樣器吸頭要清洗干凈，避免污染，加樣次序要與說明書一致，否則可導致結果錯誤，實驗重復性差。

（3）手工洗板加洗液時沖擊力不要太大，洗滌次數不要超過說明書推薦的洗滌次數，洗液在反應孔內滯留的時間不宜太長。不要使洗液在孔間竄流，造成孔間污染，導致假陰性或假陽性。

（4）要保證加液量一致。

（5）顯色液量不可過多。加樣的工作環境不能處于陽光直射的環境下，加顯色系統后要避光反應，顯色液量不能過多，以免顯色過強。

4.試劑的影響因素。應選用有質量保證試劑盒。試劑應妥善保存于4℃冰箱內，在使用時先平衡至室溫，不同批號的試劑組分不宜交叉使用。試劑開啟后要在一周內用完，剩余的試劑下次用時應先檢查是否變質，顯色劑如被污染變色將造成全部顯色，導致錯誤結果。過期的試劑不宜再用，若別無選擇，應做好雙份質控品的監測，確保結果的可靠性。

5.采取措施，避免差錯事故的發生。創造一個良好的工作環境，建立完善的質量保證體系，將質控貫穿到整個實驗過程，包括待檢者的準備、標本的采集與處理、操作過程、檢驗結果的審核、結果的登記與保存、報告單的發放等一系列的制度，用制度管人，明確責任，錯誤的結果還是能夠避免發生的。

綜上所述，在使有用ELISA試驗中，會由于各種情況影響試驗結果。但只要按說明書規范操作，規范實驗程序，出現問題后仔細分析，認真查找其中原因，并加以有效地防范和解決，就能得到準確的試驗結果。為遏制獸藥殘留提供可靠的實驗依據。