轉基因作物安全性及外源基因加工降解研究進展

朱占齊 王衛國

1 轉基因作物發展概況

轉基因作物的研究始于20世紀80年代初期。1996年，美國最早開始大規模商業化生產和銷售轉基因作物(包括大豆、玉米、油菜、土豆和西紅柿)，當年世界轉基因作物種植總面積為170萬公頃。據國際農業生物技術應用推廣站(ISAAA)信息，截止2008年底，全球轉基因作物種植面積連續13年持續增長，年種植面積增加了72.5倍，即從0.017億公頃增長至1.250億公頃，較2007年（種植面積1.143億公頃），同比增長9.4%，占全球作物種植總面積（15億公頃）的8%。如果把使用多種轉基因技術的作物計算在內，涉及轉基因技術的作物種植面積（性狀種植面積）達到1.66億公頃，全球轉基因作物累計種植面積達到8億公頃。

1996年至2008年，全球轉基因作物種植國家從6個增加到25個，其中發展中國家15個，發達國家10個。其中有10個國家種植了復合性狀轉基因作物。種植面積超過100萬公頃的有8個國家，中國排第6名，種植面積達到380萬公頃，中國種植的轉基因作物包括棉花、番茄、楊樹、牽牛花、抗病毒木瓜和甜椒。農業部2009年已頒發了兩種轉基因水稻和一種轉基因玉米的生物安全證書。

隨著轉基因技術的應用和推廣，越來越多的國家和地區采納轉基因技術進行商業化生產，轉基因作物的市場價值逐年增長。1996年轉基因作物全球市場價值為2.35億美元，到2008年激增到84億美元。據ISAAA2008年度報告顯示，自轉基因作物大面積商業化種植的13年以來，全球轉基因作物市場價值累計為440億美元。轉基因作物全球市場價值是根據Bt種子銷售價加上所有適用技術之費用進行計算的。專家預計2015年全球轉基因作物的潛在收益將達到2100億美元。可見，轉基因商業化生產能夠帶來巨大的經濟利益和其廣闊的前景。

轉基因作物的外源基因可分為三大類:第一類是輔助轉化基因，包括報告基因和抗生素抗性基因等;第二類為改良植物性狀的目的基因，如抗病毒、抗蟲、抗除草劑和品質、性狀、育性改變基因等;第三類為調控目的基因表達的序列，如啟動子、終止子和增強子序列等。這類轉基因作物主要具有抗除草劑性、抗病性和抗蟲性，稱為“輸入性狀”，轉入基因的功能是改良農藝性狀，得益的是農民和開發商。在商業化種植的轉基因作物中，抗除草劑一直是其最主要的特性，其次是抗蟲性，再次是混合型特性（抗蟲和耐除草劑等）。2008年，混合型特性品種的種植面積超過抗蟲性品種，這表明多種特性的轉基因作物將成為未來發展的重點。隨著生物技術的不斷發展，第二代轉基因作物將不斷開發“輸出性狀”，重點在改良品質，增加營養，或使食品具有醫療保健功能，或用作環保和工業原料，從而大幅度增加農副產品的附加值，并使消費者直接得益，如富含維生素A的金米稻，高賴氨酸或高油玉米，高油酸大豆，以及生產可降解塑料等的轉基因植物等。

隨著轉基因技術的快速發展以及轉基因產品在國際貿易中帶來的巨大商業利益，轉基因生物安全問題成為世界關注的熱點，引起了政府間、學術界的爭論。轉基因作物對人類、動植物、微生物和生態環境構成的危險或潛在的風險，主要涉及環境安全和食品安全。

2 國內外對轉基因作物所持態度

基于對轉基因作物生物安全的關注，一些國際性組織及各個國家都紛紛采取行動，制定了相應的管理措施。經濟與合作組織 (OECD)、聯合國糧農組織（FAO）、世界衛生組織(WHO)、聯合國開發署(UNDP)、聯合國環境規劃署(UNEP)、國際生命科學學會(ILSI)都積極地參與生物技術的安全性管理和國際協調工作。制定和提出了相應的風險管理法規、規則和辦法，以規避可能的健康和環境風險。許多國家都制定了詳細而嚴格的生物安全管理方面法規和政策，以規范轉基因作物的研究、開發、田間試驗、環境釋放、商業化生產的整個過程。并對涉及轉基因技術及其產品相關的國際貿易、知識產權、標簽政策等方面的問題給予了關注。

歐洲是最早為轉基因食品采取標識制度的地區，從1997年開始，歐盟要求各成員國監管食物銷售(特別針對各類轉基因或含轉基因成分食物)及實行標識制度，并且要求越來越嚴格，2001規定凡含有0.9%以上轉基因DNA或蛋白質的農作物或食品，在市場銷售時，必須帶有“GMO”(轉基因)字樣的標簽。2002年7月，要求在不考慮含量多少的情況下，對所有含轉基因成分的農作物或食品都進行明確標識。此外，歐洲議會還建議加強對轉基因污染事故的通報制度。2010年3月2日，歐盟委員會則首次批準商業種植由德國化工企業研制的轉基因土豆。盡管這一裁決依然充滿爭議，但卻被認為是歐盟委員會對轉基因農作物立場的轉變，意義特殊。此前，僅有少量轉基因玉米在歐盟成員國內種植。

進入21世紀，亞洲各國也制定了適合本國國情的轉基因作物管理制度，要求將轉基因食品納入監管，所有轉基因食物必須貼標簽，并且規定必須注明轉基因成分，所有轉基因食品必須經過安全檢驗。有些國家設立了GMO標簽法。在加強管理的前提下，部分國家也分別制定頒布了本國的基因工程法律或準則。2000年4月，日本曾禁止進口美國轉基因大豆，2009年10月，印度政府下屬的基因工程批準委員會批準了轉基因茄子的商業種植。此后，反對聲不斷。2010年2月9日，印度環境部長拉梅什宣布，禁止商業種植轉基因茄子。

我國對轉基因產品采取積極而謹慎的態度，一方面充分肯定轉基因作物對于促進發展中國家的農業發展和解決糧食問題的重要性，并積極支持轉基因技術的研究和應用；另一方面對轉基因作物的研究開發和應用實行嚴格的安全審查和管理制度。自1993年以來，也陸續出臺了一系列相關的政策和法規，以加強對轉基因技術及其產品的安全性管理，尊重消費者的知情權和自由選擇權。目前我國轉基因食品法規主要有：1993年國家科委頒布《基因工程安全管理辦法》、2001年5月9日實施《農業轉基因生物安全管理條例》、2002年3月20日起實施《農業轉基因生物安全評估管理辦法》，第一次將轉基因從低到高分為4個等級。2002年3月20日起實施《農業轉基因生物標識管理辦法》，規定對轉基因產品實施標識制度。2002年4月8日頒布，7月1日起實施《轉基因食品衛生管理辦法》，2004年6月12日頒布《進出境轉基因產品檢驗檢疫管理辦法》。

轉基因作物的標識管理制度的建立，對于保持生態環境、確保人類健康和動植物安全、保護消費者的知情權和選擇權具有重要意義。

3 轉基因作物安全性問題

目前，有關轉基因作物對環境可能產生的影響主要有以下幾方面：轉基因作物或其親緣野生種可能變為雜草；轉基因作物可能產生新的病毒疾病，使目標害蟲產生抗性；非目標生物受到危害、破壞生物多樣性、影響生態系統。

轉基因作物或其親緣野種可能變為雜草，而破壞生態平衡。部分栽培作物，當被插入一個如抗病、抗蟲基因時，如果其外源逃逸，可能會使其作物自身的穩定性發生改變，而趨向于雜草化。轉基因作物對非目標生物的傷害，可能會影響生物的多樣性。Losey等（1999）和Birch等（1996）研究表明，大規模種植抗蟲轉基因作物會使昆蟲種群減少，進而影響生物的多樣性。除草劑的過量施用還可能造成一些非主要作物受到傷害甚至滅絕，從而引發鏈式反應，昆蟲、鳥類、哺乳動物最終成為受害者。

研究表明，轉基因棉花Bt基因流在陸地棉品種間以及陸地棉和海島棉間發生了轉移。一些抗病毒基因逃逸到其他土壤微生物也可能產生新的致病性病毒。而且由于導入外源目的基因，轉基因作物已經突破了傳統的界、門概念，具有普通物種不具備的優勢特征。作為外來品種進入自然生態系統，往往具有較強的“選擇優勢”，可能會影響植物基因庫的遺傳結構，導致野生等位基因的丟失而淘汰原來棲息地上的物種和其它遺傳資源，乃至影響農業生態系統中有益天敵生物的種類和種群數量，使生物多樣性喪失。

對于轉基因食品安全性，爭論的熱點包括:①轉基因作物中的外源基因是否可能引起動物和人的過敏反應；②抗蟲轉基因作物產品中的殺蟲蛋白、蛋白酶活性抑制劑和殘留的抗昆蟲內毒素是否會危害人和動物的健康；③抗病毒轉基因作物中導入的病毒外殼蛋白基因可能對人和動物的健康產生危害；④抗除草劑轉基因作物的推廣可能導致除草劑在環境中殘留量增高進而污染食品和飼料；⑤轉基因作物中的抗性基因是否會轉移；⑥飼喂轉基因飼料的動物產品(肉、蛋、乳等)是否安全；⑦轉基因食品營養品質的改變是否對人體健康不利。

當目的基因的產物如果是潛在的過敏原，則該轉基因食品有可能引起人體的過敏反應。在對轉基因食品進行安全性評價時，過敏誘發性是個相當重要的因素。在已被批準商業化生產的轉基因植物食品中，外源基因編碼蛋白的過敏性均已經過相關審查。如Nebraska大學食品科技系證明，表達巴西堅果2 S清蛋白的大豆有過敏性，這是迄今已知轉基因植物未被批準商業化的例子。若轉基因食品中含對部分人群有過敏性反應的蛋白，則需加標簽，以使購買者做出選擇。

一些人認為，轉基因食品中存在一些具有抗生素抗性的標記基因，有可能在動物腸道中轉移給微生物，食用這些產品可能會使飼養動物和人體具有抗生素抗性，從而影響抗生素治療的效果。但也有人認為，食物中的基因轉移到腸道微生物的可能性極小，而食物中的遺傳物質也不會轉移到人體中。

轉基因產品的目的基因可能帶來的另一不安全因素是可能引起食品的營養成分或品質發生改變，甚至產生一些抗營養因子，對人體健康產生不良影響。另外，轉基因產品的目的基因在表達時，可能會促使一些天然毒素的表達率提高，如豆科蛋白酶抑制劑、馬鈴薯的茄堿等，也會帶來不利影響。

美國食品及藥物管理局(FDA)明確提出，轉基因作物的DNA片段很可能會被哺乳動物細胞攝入。英國官方則指出，轉基因的DNA不但可通過攝食轉移，而且可在食品加工和農場工作時通過接觸粉塵、花粉轉移。2004年6月，德國研究人員首次在用轉基因飼料喂養的奶牛產出的奶中，發現了轉基因作物的DNA片斷。美國研究機構進行了20多項轉基因飼料對畜禽的試驗，未發現轉基因飼料對畜禽的生長性能、健康狀況及肉、蛋、奶組分產生影響，在肉、蛋、奶中也未檢出轉基因蛋白和轉基因DNA。可見關于這個問題，并無定論。

轉基因食品經過不同的加工程序，轉基因的DNA片段將發生不同程度的降解和斷裂（陳穎等，2005），從而直接影響到最初的轉基因成分在最終產品中的含量和作用，所以在分析評估轉基因食品安全問題的時候應該充分考慮到食品實際加工過程，同時還應考慮最終到消費者消化道中的轉基因片段在人體內的反應等因素。轉基因食品（飼料）的安全性目前仍存在爭議，需要長時間觀察才能得出結論。

4 轉基因作物外源基因加工降解研究進展

國內外關于轉基因作物外源基因加工降解定性研究的報道目前已有許多，總結歸納如下：外源目的基因相對于內源基因來說基因片段較少，在高溫、高壓、酸堿處理、酶解、發酵和剪切力等物理、化學及生物變化影響下,會隨著基因組DNA的降解而降解（金紅等，2003）。王衛國等（2004）認為，不同飼料加工方法對飼料DNA的降解作用不同。粉碎、配料、混合、普通制粒工藝、青貯不能有效降解飼料DNA。而充足時間的高溫、高壓加工可有效降解飼料DNA。Chiter等(2000)對飼料中的一些植物性原料，如榨油前及榨油后的油菜、亞麻籽、大豆、小麥粉、新鮮的玉米粉和玉米粒、甜菜及甜菜漿中DNA的穩定性進行了研究。結果表明，高溫和高壓蒸汽可降解小麥和玉米粉中的基因組DNA和Rubisco SS基因。

Sarah R.Murray等(2007)使用實時熒光PCR技術對玉米內源基因 (葉綠體的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因及細胞壁轉化酶基因)在蒸煮、擠壓時的含量變化進行了研究,結果發現，當玉米粉在100℃下蒸煮60 min以后,DNA含量驟然下降,特別是細胞壁轉化酶基因。對玉米渣進行擠壓試驗時,當設定溫度60℃時DNA變化不明顯,而當設定溫度170℃時DNA顯著減少。當設定扭矩6 nm時,擠壓溫度170℃時與擠壓溫度60℃時相比，小片段的DNA含量明顯減少。扭矩36 nm的情況下,3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的68 bp片段和細胞壁轉化酶基因的97 bp片段幾乎不能檢測出來,該研究表明,溫度和機械力都對DNA降解有影響,更重要的是溫度和機械力的復合作用是正向加強的。

Bauer(2003)研究了加工溫度、pH值對食品中DNA降解的影響。用高效液相色譜（HPLC）法能夠定量鑒別閉環的和刻痕的質粒DNA，在緩沖液中質粒DNA的刻痕隨pH值的降低而顯著增強。事實上，在番茄漿液中也觀察到了相同的降解率。溫度和pH值的復合作用是正向加強的。對于在緩沖液中的轉基因玉米DNA達957 bp的片段在處理時間≤90 min、65℃、pH值4.0的條件下仍可檢測出。Gawienowski等（1999）研究表明，經浸泡、濕磨等加工過程能使玉米基因和質粒DNA降解，135℃加熱2 h后，DNA幾乎完全降解。而Kharazmi等（2003）認為，浸泡后又經過物理破碎處理而做成的豆奶、豆腐和熱加工做成的玉米糊和馬鈴薯，沒有檢測出大于1.1 kb的DNA片段。

沈立明等（2006）利用針對潮霉素標記基因（hpt）不同大小片段的PCR擴增體系，對hpt在轉基因大米加工食品中的穩定性進行研究，結果顯示，加工米飯、粥大于500 bp的片段已降解，僅能擴增出植物葉綠體基因rbcl片段，爆米花和鍋巴大于236 bp的hpt片段已降解，所有擴增均為陰性。hpt在轉基因大米加工食品中均已不同程度的發生了降解，不同加工方式對hpt片段降解影響顯著，在加工后hpt以較大或完整片段向食品或消化道微生物轉移的可能性減小。

覃文等（2003）為確定加工過程如加熱溫度和時間對PCR定量檢測的影響程度，將玉米粉經由不同溫度和時間處理后，提取DNA并進行定量檢測。研究發現，經過加熱處理后，加入到PCR反應體系的外源基因DNA模板量受加熱的溫度和時間影響很大，加熱溫度越高、時間越長，Ct（循環次數）值越大，但對于內源參照基因檢測的影響不明顯;當加熱溫度高且時間長(121℃、30 min)時，PCR反應也不穩定，表現Ct值變化較大。由此說明DNA被破壞嚴重時，目標DNA量越少，對PCR反應的影響越大，此時若要得到理想且穩定的檢測結果，在檢測加工產品中轉基因成分時，應適當增加加入到PCR反應體系中的目標DNA。

Anklam(2002)和 Yamaguchi(2003)等研究發現，酸性pH值對DNA的磷酸鍵產生破壞，從而造成DNA的降解。青貯加工是最簡單的飼料加工方式，經過對青貯飼料的檢測，發現其中的DNA保持完整，說明這種加工方式對DNA的降解無明顯作用。然而Hupfer等研究認為，青貯為加速DNA降解提供了一種促進條件，經過長期貯存后，基因保持完整并保留功能的可能性很小。

陳穎等（2005）研究表明，外源基因EPSPS在3種大豆加工食品的各個工藝過程中均會受到不同程度的破壞和影響。在豆腐、豆奶、豆粉的加工過程中，片段大小為1512及807 bp的外源基因僅能在原料中檢測到。當原料經過磨漿后，EPSPS基因的片段大小驟然降至800 bp以下，點漿、加熱等工藝又使得外源基因繼續降解至400 bp左右，隨著擠壓成型、高溫殺菌及噴霧干燥工藝的完成，3種大豆產品中目的基因片段大小僅為190 bp左右。

本實驗室通過設計擠壓膨化處理轉抗草甘膦基因大豆試驗，結果表明，當溫度為100℃時，擠壓膨化對外源基因的降解作用并不明顯；在溫度為115℃的擠壓條件下，EPSPS基因的片段大小降至807 bp，其外源基因僅能檢測到408 bp大小的片段，當擠壓溫度達到130℃時，外源基因片段驟然降至206 bp以下，基因組電泳結果表明，溫度越高，基因組濃度越低，拖尾現象越嚴重。擠壓膨化包括高溫、高壓以及機械剪切，使外源基因在不同的擠壓工藝加工過程中受到不同程度的降解。對外援基因降解而言，擠壓膨化溫度是主要的影響因素，其次為剪切作用，二者的復合作用是正向加強的。