裸鼠結直腸癌原位移植模型的建立和應用進展

戴功建,金黑鷹,夏建國

(1.南京醫科大學第一附屬醫院胃腸專業,江蘇南京,210029;

2.南京中醫藥大學第三附屬醫院全國肛腸醫療中心,江蘇南京,210029)

疾病動物模型是當代生物醫學研究中一種便于認識客觀事物的非常重要的實驗方法和手段。通過模型的間接性研究,可以有意識地改變那些在自然條件下不可能或不容易控制的因素,以觀察模型的反應結果,并將研究結果推及于人類疾病,從而有助于更有效地揭示人類疾病的本質和發展規律。

結直腸癌是消化系統比較常見的惡性腫瘤,隨著人們生活水平的提高、飲食結構的變化、發病率呈逐漸上升趨勢,嚴重威脅人類健康,因此對結直腸癌發病機制及相應治療措施的研究以成為目前的主要任務之一,這就要求必須建立最能體現人體結直腸癌特點的動物模型。常用的結直腸癌動物模型有腫瘤細胞株皮下接種模型、“基因敲除”模型和原位移植模型。

腫瘤細胞株皮下接種模型,建立容易、觀察方便,是一種非常常用的模型,但是由于皮下接種模型無法出現結直腸癌常見的一些生物學特性如出現肝轉移、淋巴結轉移等,因此在腫瘤的治療研究方面、特別是治療機理研究方面的價值較小。根據結直腸癌發生的分子生物學基礎建立的結直腸癌的“基因敲除模型”在理論上來講是一種比較理想的模型,目前已建立 Apc“基因敲除模型”、hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPSM1 等“基因敲除模型”[1-2],但是這些小鼠腫瘤的發生過程與HNPCC結直腸癌有較大差異,目前尚無法應用于腫瘤藥物的篩選和治療的研究,其應用價值需要進一步的探索,模型需要進一步的優化。原位移植模型是將腫瘤組織通過手術種植在體內的相應部位,從而進行相應部位腫瘤研究的方法,原位移植模型是目前廣泛應用的一種腫瘤模型。

1 原位移植模型建立的方法

原位移植模型就是將腫瘤組織通過外科手術操作移植在裸鼠的相應部位,從而產生于在體腫瘤相類似的腫瘤生物學特性。Hoffmann等建立了結腸癌的原位移植模型(SOI)模型,作者在20只移植了人結腸癌組織的裸鼠中觀察到了腹腔種植轉移、腹膜轉移、淋巴結轉移和肝臟轉移[3-4],因此原位移植模型是一種建立比較容易而且腫瘤的生物學特性與在體腫瘤較為一致,是進行結直腸癌生物學研究和腫瘤藥物篩選研究的理想模型。Rashidi,等建立結腸癌肝轉移模型,將從結腸癌肝轉移的患者中取腫瘤組織,然后種植在肝臟中,在該模型中除發現腫瘤在肝臟中生長外,還發現肝門轉移和腹腔淋巴結轉移,因此作者認為肝轉移腫瘤可以通過肝門向肝臟以外轉移[5]。但是切開腹腔進行結腸癌原位移植有一定的死亡率,而且腫瘤在體內不容易進行觀察,chen等通過肛門注射催CT-26細胞方法建立了直腸癌的原位移植模型,并對腫瘤進行而且應用于直腸癌的研究,有便于觀察的優點[6],但是該模型由于腫瘤生長比較迅速,因此可能很快快發生結腸梗阻,因此其臨床使用受到一定的限制。使用外科切除的組織塊建立結腸癌原位移植模型,由于腫瘤直接來源于腫瘤患者的組織,因此其腫瘤的生長符合該患者腫瘤的特點,避免了原腫瘤完整性的破壞,保留了瘤細胞之間、瘤細胞與間質之間、瘤細胞與宿主之間的相互作用,這種聯系是恰恰是腫瘤細胞完整表達其惡性特性尤其是轉移特性所必需的,瘤組織塊的結直癌原位移植成瘤率及轉移率均明顯提高,且晚期出現惡病質及廣泛轉移等表現,其特點與臨床患者頗為相似,是目前最為理想的模型。但是使用組織塊建立的腫瘤模型,每個研究者所采取的腫瘤標本不同,因此在治療和腫瘤發病機理研究中差異較大,可比性不強。Okazaki等[7]通過向皮下和結腸粘膜下注射細胞株建立原位模型,但是在進行腫瘤細胞注射時由于壓力較大,容易使腫瘤細胞沿淋巴管進行轉移而出現淋巴結轉移。Takahashi等[8]首先在直腸處注射腫瘤細胞,然后使用刺激性的藥物誘發動物產生結腸炎,動物在一周后可以發生直腸癌,但是由于炎癥的刺激所產生的腫瘤可能與原發腫瘤存在一定的差異。目前多數學者使用細胞株進行原位移植模型的建立和研究,首先在使用細胞株在皮下接種建立皮下接種的腫瘤,待腫瘤生長在一定的大小后移植在相應的部位。使用細胞株建立原位移植模型的好處在于細胞株其遺傳背景比較明確,不同研究者使用相同的細胞進行研究,可比性強,缺點在于使用了細胞株產生的腫瘤無法形成腫瘤腺管樣結構。目前已有使用Lovo細胞、HCT-116細胞、HT-29細胞建立的腫瘤模型[9-11],而且在結直腸癌的研究中的確有了重要的成果。Marchal F等發現使用肝高轉移細胞株HT-29可以非常穩定的建立結腸癌肝轉移模型,國內zhang等利用人結直腸癌細胞株SW480同樣獲得了裸鼠結直腸癌肝轉移模型[12]。

2 結直腸癌原位移植模型在結直腸癌研究中的應用

由于原位移植模型具有在體腫瘤類似或相同的特征,因此使用原位移植模型是進行治療研究的理想的動物模型。結腸癌的原位移植模型在腫瘤藥物的篩選、腫瘤的生物治療和結直腸癌腫瘤病例方面的研究中發揮重要的作用。

Onogawa等[13]在VEGF-C和 VEGF-D表達研究中發現,VEGF-C和VEGF-D在皮下接種模型中表達低而在原位移植模型中表達較高,作者認為VEGF-C和VEGF-D表達可能與組織的微環境有關,因此作者認為研究VEGF-C和VEGFD的表達需要使用原位移植模型。在體外研究中PDGF-R不能移植腫瘤細胞的生長,Kitadai等研究在體抑制PDGF-R表達是否可以抑制腫瘤細胞的生長,作者在裸鼠的盲腸和脾臟出注射了KM12SM結腸癌細胞,并使用 CPT-11作為對照,研究發現抑制PDGF-R表達可以抑制結直腸癌細胞的增殖和轉移。該結果與體外試驗研究不同,提示體外試驗研究與在體研究的結果存在差異,也提示使用原位移植模型可能使結直腸癌的研究更為理想[14]。Zhao等使用原位移植模型進行腫瘤轉移新基因的研究,發現使用原位移植模型所建立的腫瘤模型能蓋好的反映腫瘤的特點,得到更為可靠的結論[15]。

在治療研究中,原位移植模型同樣具有重要的作用。Wang等使用原位移植模型對西樂葆對結直腸癌的移植作用和其機理進行研究,發現西樂葆通過抑制COX-2,PGE(2)合成和VEGF and MMP-2 mRNA表達達到抑制腫瘤細胞生長的作用[16-17]。

3 結直腸癌原位移植模型在結直腸癌所面臨的問題

結直腸癌的原位移植模型在結直腸癌的治療中發揮重要的作用,但是由于原位移植模型腫瘤位于體內,觀察不是十分方便,另外在結直腸癌肝轉移方面研究門脈注射腫瘤細胞似乎要優于原位移植[18]。部分學者使用MRI和超聲對腫瘤進行檢測[19],但是由于腫瘤位置較深,不十分精確。Hoffman等建議了熒光動物模型,在腫瘤組織中首先倒入紅色或綠色的熒光,然后使用熒光對腫瘤進行觀察,是腫瘤觀察的精確程度顯著的提高[20-21];國內于曉 等采用活體成像技術監測穩定高表達熒光酶報告基因的腫瘤細胞在小鼠體內行長及轉移情況,為腫瘤治療的藥物研發提供新的有用工具[22]。但是使用熒光仍不能解決反復取樣的要求,特別是在腫瘤發病和治療的研究中,能反復取樣是進行研究的基礎,因此需要開發更為可靠、理想的動物模型,國內Jing等利用盲腸造口研究結直腸原位移植模型在這方面作了很好的嘗試[23]。

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