現代微生物技術在乳品工業中的應用

■ 曾慶坤 李 玲 中國農業科學院廣西水牛研究所

據考證，人類利用微生物來制作乳制品已經有4000 多年的歷史。人們在實踐中開始了解微生物的生長特性及規律，并逐步掌握了利用微生物的機能、代謝產物等來加工產品的技術。19世紀以來，隨著微生物學的不斷發展，微生物技術在乳品工業中得到了比較廣泛的應用。20世紀下半葉以來，生物技術發展異常迅猛，從而使微生物的研究從細胞水平發展到分子水平，以轉基因、基因芯片、PCR技術等為基礎的現代微生物技術在乳品工業中逐步得到了應用，促進了乳制品加工和質量控制技術的發展。

1 現代微生物技術的發展現狀

1.1 微生物的快速檢測技術[1]

隨著食品工業的快速發展，以及消費者對食品安全日益的關注和重視，傳統的微生物檢測方法已難以滿足人們的需求，現實社會迫切需要一些靈敏度更高，特異性更強，更加簡便快捷的食品安全檢測技術和方法。此外，隨著我國食品對外貿易的不斷擴大，建立和完善與之相適應的食品微生物安全檢測技術和體系也迫在眉睫。因此，近年來不少機構和學者都致力于快速檢測技術和方法的研究，并已開發了一些新的快速檢測技術，使傳統的培養水平逐步向分子水平邁進。

1.1.1 免疫學技術

免疫學技術是利用抗原和抗體的特異性反應原理，通過病原物刺激使機體產生免疫應答，即產生免疫球蛋白（抗體）的方法，再輔以免疫放大技術來鑒別細菌。免疫方法的優點是樣品在進行選擇性增菌后，不需分離即可采用免疫技術進行篩選。由于免疫法的靈敏度較高，檢出量低，檢測時間短，因此，在食品微生物檢測中應用較廣。通常根據檢測技術的不同可分為免疫擴散反應、凝集反應、免疫熒光反應、酶免疫等測定方法。

1.1.2 核酸探針技術

核酸探針是指帶有標記的特異DNA片斷，根據堿基互補原則，核酸探針能特異性地與目標DNA結合，然后再用特定的方法測定標記物，從而達到檢出目標微生物的目的。探針標記方式分為放射性標記、非放射性標記。放射性標記的核酸探針的特異性非常強，檢測病原微生物速度要比常規方法快很多。但目前用得較多的是用生物素——抗生物素蛋白系統標記的非放射性核酸探針，該探針已在沙門氏菌、產腸毒素大腸桿菌及乙型肝炎病毒的檢測中得到很好的應用。

1.1.3 PCR技術

雖然基因探針技術檢測速度較快，但由于靈敏度不夠高，需要對樣品進行一定時間的培養，而且每一種探針只能檢測一種菌，這影響了基因探針技術的進一步應用。1983年，Millus和 Cetus發明了擴增DNA或增加樣品中特殊核苷酸片段數量的方法：聚合酶鏈式反應，即PCR技術，這在一定程度上克服了基因探針所存在的問題。該方法通過加熱使雙鏈DNA裂解成2 條單鏈，成為引物和DNA聚合酶的模板；然后降低溫度，使寡聚核苷酸引物與DNA分子上的互補序列退火；然后升高溫度，酶促延伸引物與DNA配對合成模板。如此重復循環上述加熱變性雙鏈、引物退火和鏈延伸的過程，每次循環都會將靶 DNA擴增1 倍，典型擴增經過40 次循環能引起100 萬倍的擴增。最后用凝膠電泳、比色測定及紫外核酸檢測儀等觀察擴增結果。

PCR技術是一項全新的快速、靈敏、準確的檢測技術，有的準確率高達100%，如用同位素標記2 種基因（Lac Z和Lam B）的探針做PCR反應，檢測水源中的E.Coli。因此，PCR技術在細菌診斷方面具有廣闊的應用前景。目前已有自動化PCR檢測試劑盒，使用非常方便。如美國杜邦快立康公司的BAX+病原菌檢測系統，可檢測沙門氏菌、大腸桿菌0157、單增李斯特菌等。

1.1.4 生物芯片技術[2]

生物芯片技術是隨著“人類基因組計劃”（human genome project，HGP）的進展而發展起來的。生物芯片技術包括基因芯片、蛋白質芯片、細胞芯片、組織芯片，以及元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等新型生物芯片。

基因芯片（gene chip）技術是20世紀90年代興起的前沿生物技術。基因芯片也叫DNA芯片、DNA微陣列（DNA microarray）、寡核苷酸陣列（oligonucleotide array），是指采用原位合成（in situsynthesis）或顯微打印手段，將數以萬計的DNA探針固化于支持物表面上，產生二維DNA探針陣列，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號來實現對生物樣品快速、并行、高效地檢測或醫學診斷。由于常用硅芯片作為固相支持物，且在制備過程運用了計算機芯片的制備技術，所以稱之為基因芯片技術。由于基因芯片的信息量大，操作簡單，可靠性好，重復性強，以及可以反復利用等，因此，被廣泛應用于食品檢測中有害微生物和轉基因成分的鑒別。與傳統的細菌培養、生化鑒定、血清分型等檢測方法相比，基因芯片技術具有以下優點：一是基因芯片可以實現微生物的高通量和并行檢測，一次實驗即可得出全部結果；二是操作簡便快速，整個檢測只需4 h就可以得出結果，而傳統方法一般需4～7 天；三是特異性強，靈敏度高。

1.2 航空育種技術[3]

傳統上，微生物育種通常采用誘變育種方法，誘變劑主要分物理和化學兩大類。物理誘變劑有紫外線、X射線、γ射線（Co60）等。化學誘變劑有亞硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯和亞硝基胍等。

航天育種是利用微生物經大劑量、高強度宇宙射線輻射及微重力場作用后發生變異來進行誘變育種的新技術。該方法是將微生物細胞懸浮液送入高空，停留一定時間后返回地球進行培養；然后采用適當的方法淘汰負變異菌株，選出一些性狀優良的正變異菌株；再根據目標產品特點復篩出生命力旺盛，生產速度快，代謝產物得率高，以及品質優良的菌株，并排除生理變異與遺傳變異，就可得到經航天培育的優良微生物菌種。航天育種具有無污染，操作方便的優點，效果非常明顯。

我國從20世紀90年代開始通過高空氣球搭載，將微生物送入太空進行誘變育種，并成功返回。隨著我國航天技術的發展，未來我國食品微生物誘變育種將會取得更大的成效。

1.3 轉基因技術[4]

基因工程技術是現代生物技術發展的基礎，微生物是應用基因工程技術最基本且重要的—環，因此，轉基因微生物的構筑、開發是所有轉基因食品研究的基礎。目前，一些利用轉基因微生物生產的酶（如凝乳酶）已在食品工業中得到了廣泛的應用。這些酶具有產量高，品質高，穩定性好和價格低等優點。基因工程凝乳酶的研究始于1970年，目的在于改善干酪的生產方法與提高凝乳酶性能，1998年第1 個轉基因微生物生產的凝乳酶產品面市，開始在干酪生產中試用。基因工程凝乳酶產品的純度高，且含 100%凝乳酶 （小牛胃萃取液僅含70%～90%凝乳酶），所制造的干酪在產品得率與品質上均優于傳統小牛胃凝乳酶制造的干酪。美國已有超過70%的干酪是用轉基因微生物生產的凝乳酶制造的。

2 現代微生物技術在乳品工業中的應用

2.1 生奶中微生物的檢測和鑒定

在生奶的收購、加工和產品質量控制等過程中，微生物檢測是一項必不可少的同時又是比較繁雜的工作。此外，由于傳統微生物檢測技術耗時比較長，給乳制品生產管理和產品品質控制帶來了許多困難和問題。利用免疫學和基因探針、基因芯片等技術可實現乳制品中微生物尤其是致病微生物的快速檢測，原本需要幾天的檢測時間，可縮短至幾小時，這樣可使產品在出廠前完成檢測工作，確保產品的質量安全。

此外，利用基因技術和PCR技術可對微生物進行鑒定，如乳酸菌和轉基因微生物的鑒定，這些方法具有速度快，準確性高，穩定性好等特點，目前已得到很好的應用。

2.2 酶制劑的生產

凝乳酶、乳糖酶、脂肪酶及其它蛋白酶、肽酶等是乳品工業常用的酶制劑。凝乳酶主要用于干酪生產，以往主要使用小牛皺胃酶，然而，提取小牛皺胃酶需要宰殺大量的犢牛，其產量受到一定的限制，難以滿足干酪生產不斷增長的需要。經過不斷的探索，人們發現一些微生物產生的酶可應用于干酪生產，有的微生物還能生產純凝乳酶。用乳糖酶處理牛奶可使牛奶中的乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，解決乳糖不耐癥及乳糖在冰淇淋中砂狀結晶析出的問題。在乳制品加工時，添加適量的脂肪酶可增加干酪和黃油的香味，這樣既可節約黃油的用量，還可以提高產品的風味。在干酪中添加酶，還可縮短干酪的成熟時間。

采用微生物基因工程技術可生產大量乳品工業用酶，如將牛凝乳酶原生產基因植入大腸桿菌，用發酵法生產真正的凝乳酶，該技術已獲成功，轉基因凝乳酶已大量應用于干酪生產。隨著蛋白質工程技術的快速發展，不久的將來會有越來越多更穩定，特異性與催化效率更佳的，利用轉基因微生物生產的酶應用于工業化生產。

2.3 益生菌的改良

益生菌是一類可以在人或其它寄主體內（主要是腸道）定植，有利于人體或寄主健康的微生物。常見的益生菌主要有乳酸菌、雙歧桿菌等，這些益生菌的攝入和在人體腸道內定植，不僅有利于改善腸道內上皮細胞和黏膜細胞的粘附性，而且通過分泌一些抗菌物質抑制有害菌群的生長，從而起到保健作用。

通過益生菌的基因組學研究，可掌握益生菌功能特性的控制基因，從而通過轉基因技術獲得優良性狀的益生菌菌株。此外，還可對微生物的代謝途徑進行調控，從而達到精確改造益生菌的細胞特性的目的。例如，經過改良的乳酸菌，可以通過一個相對簡單的代謝途徑，把乳糖轉化為乳酸，從而適應高乳糖的生長環境。另外，還可通過改造代謝途徑來生產不同風味的酸奶，這對于進行市場的差異性劃分是非常有益的[5]。

2.4 功能活性產品的生產

研究表明，乳蛋白經水解后可產生一些多肽類物質，這類物質具有增強免疫功能，抗凝血，抗過敏，降血壓和降低膽固醇等功效[6]。利用不同的蛋白酶可將乳蛋白分解成特定的、具有不同功能特性的多肽。利用微生物發酵法，即通過微生物生長過程中產生的胞內、胞外酶的作用，也可將乳蛋白分解成具有一定生物活性的多肽物質[7]，而通過轉基因等技術可得到特異性強的高產菌株。

2.5 細菌素的應用

乳酸鏈球菌肽（Nisin）作為一種多肽類物質，可抑制一些細菌的生長，同時，這種物質添加于食品中不會被其中的微生物分解，對人體無毒害作用。但乳酸鏈球菌肽對蛋白水解酶 （胰酶、唾液酶、消化酶等）很敏感，人食用后在消化道內很快被水解成氨基酸，并且不改變腸道內的正常菌落，也不會與常用的其它抗生素（如青霉素、鏈霉素等）產生交叉抗性，是一種安全的防腐劑，可以用作乳制品的保鮮劑。采用基因重組技術構建高產、廣譜抗性菌株，可以獲得抗菌效果更好的天然防腐劑。

2.6 合成香味物質，改善產品的風味

許多微生物如細菌、真菌、酵母菌在生長過程中都能夠產生香氣物質，利用微生物這一特性可以合成許多風味物質。如合成含N的雜環類吡嗪化合物，可產生菠蘿、馬鈴薯、爆米花、堅果味；內酯化合物具有水果味、可可味、奶酪味及堅果味；萜烯類化合物主要有香茅醇、香味醇、里那醇等；細菌菌株還能夠降解丁香醛產生香蘭素，可用作產品的增香劑[8]。用微生物合成法生產香味物質具有生產工藝簡單，成本低，產品品種多以及風味柔和等特點，這些香味物質可用于開發不同風味的乳制品，以滿足不同消費者的需要。

3 前景展望

隨著生物技術的進一步發展，現代微生物技術將會在乳制品衛生質量檢測，益生菌的改良和選育，新型發酵乳制品的開發，酶及添加劑的生產，以及產品質量控制等各方面得到廣泛的應用，這對于促進乳品工業科技進步，開發新型乳制品，提高行業工作效能，降低運行成本，有效控制產品質量和保障乳品質量安全等都具有非常重要的作用。

[1]李勤.食品微生物檢測技術和方法概論.食品工程，2006（4）：44-46.

[2]王志存，葛長榮.基因芯片技術在病原性食品微生物檢測中的應用.肉類工業，2006（12）：40-42.

[3]李大錦，王汝珍.航天育種：21世紀釀造微生物誘變育種的革命.上海海洋，2002（3）：16.

[4]朱文深.透視國際轉基因微生物與其產物.中外食品工業信息，2003（3）：6-7.

[5]柳瑩.乳酸桿菌改良技術的新進展.食品研究與開發，2002，23（6）：28-31.

[6]梁金鐘，陳成，徐速等.乳蛋白生物活性肽的開發與利用.中國乳品工業，1999，27（1）：28-29.

[7]趙云財，滕波，吳鏑等.微生物發酵法生產乳蛋白活性肽口服液.中國乳品工業，2004，32（8）：24-26.

[8]齊軍茹，蘇景如，彭志英.生物技術在食品風味物質生產中的應用.食品科技，2002（9）：9-11.