缺血預處理對無心跳供體大鼠移植肺缺血再灌注損傷的保護作用

徐松濤 郭衛(wèi)剛 譚黎杰 丁建勇 王 群

(復旦大學附屬中山醫(yī)院胸外科,復旦大學呼吸病研究所,上海 200032)

供體嚴重短缺是開展肺移植最主要的制約因素[1]。肺是唯一不依賴灌注進行細胞呼吸的器官,肺實質(zhì)在循環(huán)停止以后仍可能存活一段時間[2],這是無心跳供體(non-heart-beating-donor,NHBD)肺移植的理論基礎。缺血預處理(ischemia preconditioning,IP)是指通過短暫的缺血-再灌注刺激啟動內(nèi)源性保護機制,從而增強對接下來更嚴重的缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)的抵抗,這涉及改變細胞內(nèi)的能量代謝、離子通道和細胞骨架的介質(zhì)等[3-4]。迄今對肺IP的研究報道仍然較少[3],未見有關IP在NHBD肺移植領域的體內(nèi)研究報道。

我們已經(jīng)成功建立了可以耐受1 h熱缺血時間的NHBD大鼠同種異體左肺原位移植模型[5]。本實驗擬研究IP對熱缺血1 h的NHBD大鼠移植肺的IRI是否有影響及其作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠,體質(zhì)量220～260 g,由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司(SINO-BRITISH SIPPR/BK LAB ANIMAL Ltd.)提供。

1.2 主要試劑和器材 5-羥基癸酸鹽(5-hydroxydecanoate sodium salt,5-HD)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)(美國SIGMA公司);丙二醛(malondialdehyde,MDA)、總抗氧化能力(total antioxidative capacity,T-AOC)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);大鼠白介素6(IL-6)、大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫診斷試劑盒(美國Adlitteram Diagnostic Laboratories);低鉀右旋糖苷(low patassium dextran,LPD)液[Perfadex(r),Vitrolife AB,瑞典Goteborg公司];動物呼吸機(美國 Harvard volume ventilators,Inspira ASV)。1.3 動物分組 將32只SD大鼠按供受體隨機配對成16對,分成4組施行NHBD同種異體左肺原位移植。分別為 NHBD熱缺血1 h組(對照組,NHBD 1 h)、IP 組(實驗組,IP)、IP+5-HD(實驗組,IP+5-HD)和 IP+DMSO(溶劑對照組,IP+DMSO),每組4對。NHBD 1 h組供受體鼠均無預處理措施;IP組供體鼠放血前先給予IP;IP+5-HD組供體鼠給予IP,受體鼠移植術前30 min給予5-HD 5 mg?kg-1腹腔注射;IP+DMSO組供體鼠給予IP,受體鼠移植術前給予同等劑量溶劑DMSO腹腔注射。5-HD必須溶于DMSO,設立溶劑對照組的目的是為了觀察DMSO是否影響實驗結果。

1.4 動物手術和標本采集 各組熱缺血時間均為1 h。IP方案為開胸后夾閉大鼠左側肺門5 min,開放10 min,然后放血處死大鼠。熱缺血1 h后,摘取供肺置于4℃LPD液中4 h,然后采用“袖套”法行同種異體左肺原位移植。

再灌注 10 min、1 h、2 h,分別抽取 0.15 mL 頸動脈血測血氣。再灌注10 min、1 h、2 h,記錄呼吸機上顯示的氣道壓力(Paw),根據(jù)公式CL(L/cmH2 O)=肺容積變化(Vt)/跨肺壓的變化(ΔP),得出相應的雙肺順應性數(shù)值。再灌注2 h后從原切口進胸,抽取0.2 mL左肺靜脈血測血氣;隨后從頸動脈抽血處死動物,采血約2 mL置入離心管,以3 000 r?min-1離心 20 min,取上清液100μL置于凍存管,-80℃冰箱保存待測。自左側肺門離斷移植肺,切取上1/3肺組織測定肺濕/干質(zhì)量比值(W/D);切取下1/3制作病理切片和電鏡標本;余肺切成100 mg左右小塊放入凍存管,-80℃冰箱保存待測。病理切片由富有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師雙盲讀片。光鏡下病理評分基于以下變量:肺泡和間質(zhì)水腫,中性粒細胞浸潤,出血,壞死。嚴重程度評分如下:無損傷=1(無該項病理改變);損傷25%=2(病理變化輕且很局限);損傷50%=3(病理變化中等且局限),損傷75%=4(病變中等但廣泛或局部很顯著);彌漫性的損傷=5(非常顯著的廣泛性病理改變)。每個樣本有3個切片,被隨機分析,平均值作為樣本的評分。透射電鏡觀察細胞超微結構變化。

1.5 實驗方法 測定移植肺組織總蛋白含量(考馬斯亮藍染色法)、移植肺組織和血清 MDA含量(TBA法)、移植肺組織和血清 T-AOC、肺組織MPO活性、移植肺組織和血清TNF-α和IL-6含量(雙抗體夾心ABC-ELISA法)、細胞凋亡(TUNEL法)(按試劑盒說明書操作)。

1.6 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料采用均數(shù)±標準差描述,各組之間比較采用單因素方差分析,如參數(shù)間的差異有統(tǒng)計學意義,則進一步采用Student-Newman-Keuls進行各組間參數(shù)的兩兩比較。P＜0.05表示參數(shù)間的差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 血氣分析 將再灌注后右頸動脈血PaO2數(shù)值減去自身未移植前PaO2的數(shù)值,可以大致反映移植肺的氧合情況(表1),結果顯示再灌注10 min、1 h和2 h時,IP組術后氧合優(yōu)于NHBD 1 h和IP+5-HD組(P＜0.05)。再灌注2 h后,比較各組左肺靜脈血PaO2數(shù)值可以更準確地反映移植肺的氧合(表2),IP組優(yōu)于NHBD 1 h組以及IP+5-HD組(P＜0.05)。

2.2 雙肺順應性 表3顯示再灌注1 h和2 h,IP組雙肺順應性優(yōu)于NHBD 1 h以及IP+5-HD組(P＜0.05)。

2.3 再灌注2 h移植肺W/D數(shù)值、組織形態(tài)學改變和凋亡 表4顯示移植肺再灌注2 h,IP和IP+DMSO組W/D數(shù)值較低,肺水腫程度較輕(P＜0.05)。光鏡下觀察各組均可見肺泡壁塌陷,間質(zhì)血管擴張充血,實質(zhì)及間質(zhì)內(nèi)白細胞浸潤,肺泡腔內(nèi)有紅細胞及滲出液。NHBD 1 h組和IP+5-HD組肺損傷程度相對較重;IP組以及IP+DMSO組肺泡結構損害、肺間質(zhì)水腫、間質(zhì)血管充血程度減輕,肺泡腔內(nèi)有散在紅細胞漏出,可見少量滲出。但各組移植肺損傷程度評分的差異無統(tǒng)計學意義。IP組以及IP+DMSO組的凋亡指數(shù)顯著高于NHBD 1 h組和IP+5-HD組(P＜0.05);IP+5-HD組與NHBD 1 h組的差異無統(tǒng)計學意義(圖1)。

表1 4組再灌注后右頸動脈血PaO2與自身術前值差的比較(ˉx±s)

表2 4組再灌注2 h右頸動脈和左肺靜脈血PaO2數(shù)值比較(ˉx±s)

表 3 4組再灌注后肺順應性數(shù)值比較(ˉx±s)

表4 4組再灌注 2 h移植肺W/D、光鏡下肺損傷程度評分和凋亡指數(shù)比較(ˉx±s)

圖1 4組細胞凋亡比較(TUNEL×250)A:NHBD 1 h;B:IP;C:IP+5-HD;D:IP+DMSO

電鏡下觀察NHBD 1 h和IP+5-HD組可見內(nèi)皮細胞水腫、空泡化、線粒體腫脹、部分可見嵴斷裂,細胞間隙增大。Ⅰ型細胞扁平,胞漿空泡化明顯,部分線粒體膜破壞。Ⅱ型細胞線粒體腫脹明顯,線粒體嵴減少,細胞質(zhì)空泡化明顯,肺泡隔明顯腫脹。IP組和IP+DMSO組各型細胞結構較完整,輕度腫脹,線粒體嵴部分模糊,空泡增多,損傷較NHBD 1 h組和IP+5-HD組輕。

2.4 再灌注2 h的過氧化指標和細胞因子 比較移植肺再灌注2 h時各組血清和肺組織MDA、血清和肺組織T-AOC含量、肺組織MPO含量以及肺組織TNF-α和 IL-6蛋白定量,結果示IP組和IP+DMSO組與NHBD 1 h組的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);IP+5-HD組與NHBD 1 h組的差異均無統(tǒng)計學意義;各組血清TNF-α和IL-6濃度之間的差異無統(tǒng)計學意義(表5)。

表5 4組再灌注2 h的過氧化指標和細胞因子比較(ˉx±s)

3 討 論

1986年,Murry等[6]在研究犬心肌梗死模型時提出了IP的概念。相對其他器官而言,對肺的IP研究報道較少[3-4],至今未見有關IP在肺移植領域的臨床應用,也未見有關IP在NHBD肺移植領域的體內(nèi)研究報道。本實驗結果顯示,IP能夠減輕NHBD移植肺再灌注早期各時間點右頸動脈血PaO2降低的程度,再灌注2 h的左肺靜脈血PaO2水平顯著高于未預處理組,提示IP能夠改善NHBD移植肺的氧合功能。此外,IP還能改善再灌注2 h移植肺的順應性,減輕肺水腫程度,減少細胞凋亡,改善肺組織形態(tài)學變化。因此,IP對NHBD移植肺的IRI有較強的早期保護效應。

早先在心肌IP的研究中,多采用短暫“缺血-再灌注”4至6個循環(huán),以誘導IP的保護作用。一般認為應該在最終引起損傷的“缺血-再灌注”前即刻進行預處理。至于預處理究竟應該持續(xù)多久,預處理幾次,各類研究方法和對象不同,所得出的結論也有差異。近幾年來,研究者們普遍采用單次“缺血-再灌注”方案,在肝、腎等的IP研究中,單次方案對IRI的保護效果與以往多次循環(huán)方案類似[7]。本實驗采用單次5 min缺血+10 min再灌注的IP方案,結果顯示對熱缺血1 h的NHBD供肺同樣能夠產(chǎn)生保護作用。

IP可能的最終效應包括改變細胞內(nèi)ATP、糖類和蛋白質(zhì)代謝,離子通道和細胞骨架的介質(zhì)。IP可以減少IRI過程中的能量需求,減緩代謝產(chǎn)物的堆積,減少糖酵解。IP對組織產(chǎn)生延遲保護作用的介質(zhì)包括了NO合成酶、COX-2、醛糖還原酶、Mn-SOD、熱休克蛋白和ATP敏感的鉀通道(ATP-sensitive potassium channels,K-ATP)等[3-4,8]。本實驗結果顯示移植肺再灌注2 h時,IP組的血清MDA和肺組織MDA含量較對照組顯著降低,血清和肺組織 T-AOC顯著增高,肺組織 MPO含量以及TNF-α和IL-6含量顯著降低,提示IP可以提升移植肺和機體的總抗氧化能力,減輕脂質(zhì)過氧化水平,減少再灌注早期肺組織中性粒細胞的聚集和細胞因子的釋放,抑制移植肺的炎性反應,減輕IRI程度,從而對熱缺血1 h的NHBD供肺產(chǎn)生保護作用。而這種保護作用可以被線粒體K-ATP阻斷劑5-HD消除,說明線粒體K-ATP開放在IP對IRI的早期保護機制中起到了重要作用。另外,5-HD的溶劑DMSO對本次實驗結果無明顯影響。

本實驗結果顯示,移植肺再灌注2 h時,肺組織中TNF-α和IL-6含量在IP組顯著低于對照組,而血清中兩者的濃度在各組間均無顯著差異,說明再灌注早期,IP的效應主要還是作用在靶器官,對機體的全身炎性反應影響不大。

1 Bar r ML,Bourge RC,Orens JB,et al.Thoracic organ transplantation in the United States,1994-2003[J].Am J Transplant,2005,5(4 Pt 2):934-949.

2 Date H,Matsumura A,Manchester JK,et al.Evaluation of lung metabolism during successful twenty-four-hour canine lung reservation[J].J Thorac Cardiovasc Surg,1993,105:480-491.

3 Luh SP,Yang PC.Organ p reconditioning:the past,current status,and related lung studies[J].J Zhejiang Univ Sci B,2006,7:331-341.

4 朱 穎,劉 蓉,劉文新,等.兔局灶性腦缺血預處理誘導缺血耐受的實驗研究[J].中國臨床醫(yī)學,2008,15(5):602-604.

5 徐松濤,郭衛(wèi)剛,譚黎杰,等.無心跳供體大鼠同種異體左肺原位移植模型的熱缺血時限[J].復旦學報(醫(yī)學版),2008,35:720-725.

6 Murry CE,Jennings RB,Reimer KA.Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation,1986,74:1124-1136.

7 Torras J,Herrero-Fresneda I,Lloberas N,et al.Promising effects of ischemic preconditioning in renal transp lantation[J].Kidney Int,2002,61:2218-2227.

8 Hausenloy DJ,Yellon DM.Survival kinases in ischemic preconditioning and postconditioning[J].Cardiovasc Res,2006,70:240-253.