葡萄糖對INS-1細胞活性氧及PTEN表達的調控

肖 玲 周湘蘭 周連華 楊志紅 胡仁明 劉珊林 黎丹鳳 何建秋

(1.復旦大學附屬金山醫院內分泌科,上海 200540;2.復旦大學附屬華山醫院內分泌科,上海 200040;3.復旦大學自由基調控與應用研究中心,上海 200032)

糖尿病是由于靶組織細胞對胰島素敏感性降低合并胰島β細胞功能不足引起,以慢性高血糖為特征的多因素疾病。其中胰島β細胞數量及功能不足是導致糖尿病發生的最根本原因,因此胰島β細胞功能調控是糖尿病研究的重要課題。

影響胰島β細胞數量及功能的因素主要有高糖、高脂、遺傳、年齡、胰高血糖素樣肽I(GLP-1)、胰淀素、胰島素抵抗。其中大多數因素均可導致機體氧化應激增加,包括活性氧(reactive oxygen species,ROS)的增多。ROS化學性質活潑,可直接攻擊核酸、蛋白等生物分子,影響機體功能。低濃度ROS可以作為信號分子參與許多生理過程,如生理濃度的ROS作為信號分子之一參與葡萄糖刺激胰島β細胞分泌胰島素(GSIS)的信號通路[1-3]。ROS作為細胞內信號分子,其下游信號途徑有多種[4],包括PTEN(phosphatase with sequence homology to tensin)及其他的線粒體通透轉運孔道(PTPs)。目前,尚不清楚ROS是否對胰島β細胞PTEN具有調節作用,ROS是否通過調控第10號染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物基因(PTEN)而參與葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)信號通路。本研究通過不同濃度糖及H2O2對胰島細胞系(INS-1)干預,探討ROS調控胰島素分泌機制。

1 資料與方法

1.1 材料 INS-1細胞由復旦大學附屬華山醫院內分泌研究所提供。RMPI1640培養基為GIBCO公司產品,胎牛血清為Hyclone公司產品;大鼠胰島素酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒為Mercodia公司產品;細胞ROS檢測試劑盒為碧云天生物技術研究所產品;逆轉錄試劑盒為TOYOBO產品;2×Taq PCR MasterMix為 Tiangen公司產品;30%H2O2溶液為分析純產品。

1.2 方法

1.2.1 INS-1細胞培養與干預 INS-1細胞(第75代),置20%FBS1640培養液培養,細胞貼壁生長。傳至4～5代后,以1×106/孔接種在6孔板,培養貼壁后,棄培養液,用PBS洗2次,各孔分別加入終濃度為 0、3、7、11和20 mmol?L-1的無菌葡萄糖和終濃度為 0、1 μmol?L-1、2 μmol?L-1、4 μmol?L-1、6 μmol?L-1和 8μmol?L-1的 H2O2,在無血清培養液孵育30 min,收集細胞檢測 ROS,抽提 RNA,留取培養液測胰島素分泌。

1.2.2 INS-1細胞分泌胰島素的檢測 按ELISA試劑盒說明書操作。

1.2.3 INS-1細胞內ROS的檢測 DCFH-DA熒光法,按試劑盒操作。

1.2.4 反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法測INS-1細胞PTENmRNA的表達 分別收集高糖和H 2 O2干預后的INS-1細胞,提取總 RNA,逆轉錄成cDNA,進行PCR擴增,產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。PTEN 引物序列:F:5′-TGGCTAAGTGAAGACGACAATC-3′;R:5′-CGCACGCTCTATACTACAAATG-3′;擴增長度:597 bp;變性溫度94℃,退火溫度為52.7℃,延伸溫度72℃,25個循環 。β-actin 引物序列:F:5′-TGGCTAAGTGAAGACGACAATC-3′ R: 5′-CGCACGCT CTATACTACAAATG-3′擴增長度:500 bp;變性溫度94℃,退火溫度為52.7℃,延伸溫度72℃,25個循環。

1.3 統計學分析 使用SPSS 13.0軟件,采用單因素方差分析和兩兩比較的Dunnett方法分析數據,檢測數據用(ˉx±s)表示,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 葡萄糖對INS-1細胞胰島素分泌、ROS的影響 隨著葡萄糖干預濃度升高,INS-1細胞分泌胰島素和胞內ROS水平逐漸增高。經Dunnett法檢驗,對照組與干預組之間差異有統計學意義,經干預后胰島素分泌及胞內ROS水平均較對照組明顯升高(表1)。

2.2 H2 O2對INS-1細胞胰島素分泌、ROS的影響隨著H2O2干預濃度升高,INS-1細胞分泌胰島素和胞內ROS水平逐漸增高。經Dunnett法檢驗,對照組與干預組之間差異均有統計學意義(表2),經干預后胰島素分泌及胞內ROS水平均較對照組明顯升高。

表1 不同濃度葡萄糖干預INS-1細胞后,細胞分泌胰島素和胞內ROS變化(ˉx±s)

表2 不同濃度H2 O2干預INS-1細胞后,細胞分泌胰島素和胞內ROS變化(ˉx±s)

2.3 葡萄糖對INS-1細胞PTENmRNA表達的影響 隨著葡萄糖干預濃度升高,PTENmRNA表達受到抑制,呈下降趨勢,但當葡萄糖濃度超過 11 mmol?L-1時,抑制作用消失,PTENmRNA表達上升。經單因素方差分析法檢驗,各組細胞PTEN-mRNA表達不全相同(P＜0.001);經Dunnett法檢驗各干預組與對照組,結果顯示葡萄糖濃度為 7 mmol?L-1和11 mmol?L-1與對照組相比差異顯著,提示葡萄糖濃度為7 mmol?L-1和11 mmol?L-1時,明顯抑制PTENmRNA表達;Dunnett法檢驗各干預組與11 mmol?L-1干預組,結果顯示葡萄糖濃度為20 mmol?L-1組與 11 mmol?L-1組之間存在顯著差異,提示葡萄糖濃度為 20 mmol?L-1時,對PTENmRNA表達抑制作用消失(圖1、圖3)。

2.4 H2O2對INS-1細胞PTENmRNA表達的影響 隨著H 2 O2干預濃度升高,PTENmRNA表達受到抑制,呈下降趨勢,但當H2O2濃度超過 2μmol?L-1時,抑制作用消失,PTENmRNA表達上升。經單因素方差分析法檢驗,各組PTENmRNA表達不全相同(P=0.006);經Dunnett法檢驗各干預組與對照組,結果顯示 H 2O2濃度為2μmol?L-1與對照組相比有顯著差異,提示H 2O2濃度為2μmol?L-1時,明顯抑制PTENmRNA表達;Dunnett法檢驗各干預組與2μmol?L-1干預組,結果顯示H2O2濃度為 1 μmol?L-1、6 μmol?L-1、8 μmol?L-1組與2 μmol?L-1組之間差異均有統計學意義。提示低濃度H2O2抑制PTENmRNA表達,H2O2濃度為2μmol?L-1時,抑制作用最強;隨著H2O2濃度升高抑制作用減弱,當H2 O2濃度達 6 μmol?L-1、8 μmol?L-1時,對 PTEN-mRNA表達抑制作用消失(圖2、圖4)。

3 討 論

2008年,糖尿病病理生理研究專家DeFronzo教授指出,β細胞衰退的進程比我們想象的要早得多。胰島素和葡萄糖的比值在正常糖代謝的肥胖人群幾乎已經下降了一半,胰島β細胞功能損失在空腹血糖受損人群中可達50%,在糖耐量受損人群中可達 80%,而在新診斷的 2型糖尿病患者中達90%,β細胞存活量損失50%。

同其他細胞類型相比,胰島β細胞的抗氧化酶表達低下,清除ROS減少,使得胰島細胞更易遭受ROS損傷,同時也為 ROS參與胰島β細胞代謝信號通路提供了便利[5]。ROS作為細胞內信號轉導分子,其作用的下游信號途徑包括以下幾種:電壓門控的 K+通道[6]和 Ca+通道[7-8];PTEN及其它的PTPs[4]、c-JUN NH2末端激酶[9]、細胞外信號調控激酶[10]和NFκB[11]等。其中,PTEN是蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)家族的一員,它通過負向調控磷酯酰肌醇 3-激酶(PI3K)-蛋白激酶 B(AKT)信號通路[9],成為重要的腫瘤抑制因子。并成為很多細胞內信號通路的重要調控點。已有越來越多的研究者[10]開始對PTEN蛋白表達、穩定性及PTEN基因進行研究。迄今為止,尚無ROS是否對胰島β細胞PTEN表達具有調節作用的報道,而葡萄糖是否通過誘導低濃度ROS生成,抑制胰島β細胞PTEN表達而調控胰島素分泌有待驗證。本研究分別用不同濃度葡萄糖和H 2 O2干預INS-1細胞30 min,發現中低濃度葡萄糖和H2O2都可以促進細胞分泌胰島素,同時,細胞PTENmRNA表達受到抑制,但隨著刺激濃度進一步升高,這種抑制PTENmRNA表達作用消失,而胰島素分泌繼續增加。有很多其他研究也支持了本實驗結果:Pi等[5]通過實驗證實,在INS-1細胞和正常小鼠胰島細胞,高糖刺激細胞分泌胰島素時,細胞內ROS濃度升高,用低濃度H 2 O2刺激細胞也可使細胞分泌胰島素增加。而用抗氧化劑則可抑制細胞分泌胰島素。有研究[1-2]發現,H 2O2和可刺激細胞內產生H 2 O2的四氧嘧啶,都能刺激大鼠胰腺和INS-1細胞分泌胰島素,并伴有細胞內Ca+升高。在神經母細胞瘤細胞內,胰島素刺激的細胞內ROS升高,可以氧化抑制PTEN的活性,并引起細胞內PIP3升高[3]。在神經膠質細胞瘤細胞,H2 O2可以氧化抑制PTEN的活性,同時伴有細胞內PI3K活性增強和PIP3濃度升高;而在敲除PTEN基因的神經膠質細胞瘤細胞內,H2O2刺激則對PI3K活性和PIP3濃度無影響。在吞噬細胞的研究[10-11]也提示H 2O2可以氧化抑制PTEN的活性。但至今,除H2O2氧化抑制PTEN的活性外,對PTEN表達影響的報道少見。

本研究發現在高濃度葡萄糖和 H 2 O2水平,PTENmRNA表達不再受到抑制,而有上升趨勢。隨著干預INS-1細胞的葡萄糖和H2 O2濃度升高,PTENmRNA表達被抑制,但當葡萄糖和H2O2濃度升高超過一定程度時,這種抑制作用消失。ROS氧化抑制PTEN途徑只是GSIS信號轉導途徑之一,而經典的ATP依賴胰島素分泌途徑仍然占主要地位;同時,在GSIS過程中,除 ROS外可能還存在很多其它因素影響PTENmRNA的表達。

很多轉錄因子在轉錄水平對PTEN基因表達起調節作用。早期生長反應-1(EGR-1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和p53都可以直接與PTEN基因的啟動子部位結合,并誘導轉錄活化[12]。而核因子-κB(NF-κB)則可以抑制PTEN 表達。用藥物活化 PPARγ可以誘導PTEN基因表達[13],而細胞因子誘導的 NF-κB活化則可以使PTEN基因表達下調。這些均提示有一個相當復雜的系統在轉錄水平對PTEN基因表達進行調節。

綜上所述,在INS-1細胞內,中低濃度葡萄糖代謝會產生低濃度 ROS,ROS會抑制PTEN基因的轉錄,逆轉其對PI3K/AKT信號通路的負向調控,從而介導胰島素分泌。這種抑制PTEN表達作用在一定濃度范圍內,隨濃度升高抑制作用增強;但超過一定濃度范圍后(如葡萄糖＞11 mmol?L-1,H 2O2＞2 μmol?L-1),則抑制PTEN 表達,介導胰島素分泌的作用消失。這與臨床觀察一致,即血糖升高刺激胰島素分泌增加,但血糖過高反過來對β細胞有毒性損害,而空腹血糖超過11.1 mmol?L-1時高糖毒性明顯。這種ROS對PTEN表達調控的雙重性,體現了機體ROS作用的復雜性,對我們抗氧化劑臨床應用研究有重要啟示作用。同時也可能是PTEN轉錄受一個復雜的系統調控的結果反映。此外,ROS對PTEN在蛋白表達和功能水平上的氧化抑制作用對其下游信號調節也至關重要,葡萄糖刺激引起的ROS升高是否在蛋白表達和功能水平對胰島β細胞PTEN有抑制作用,還有待于進一步研究。

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