嗜鉻細胞瘤基因突變檢測芯片的開發和驗證

武多嬌 周曉鷗 高平進 朱鼎良

(1.復旦大學附屬中山醫院實驗研究中心,上海 200032;2.上海市高血壓研究所,上海 200025)

基因芯片技術是將大量探針固化于固相支持物上,然后與標記的樣品雜交,通過對雜交信號的檢測分析,得出樣品的遺傳信息。該技術具有高通量、大規模、快速、高效、高靈敏度等優點,在科研領域、生物制藥和醫學診斷上都具有良好的應用前景[1-2]。在疾病診斷方面,由于大部分疾病與多基因有關,利用DNA芯片可以快速尋找多個基因和位點與疾病的相關性,從而為研制相應的藥物和提出新的治療方法提供依據。

嗜鉻細胞瘤是由腎上腺髓質的嗜鉻細胞及交感神經節細胞形成的腫瘤,瘤組織持續或間斷地釋放大量兒茶酚胺引起持續性或陣發性高血壓和多個器官功能及代謝紊亂。嗜鉻細胞瘤患者中約10%為孟德爾遺傳疾病患者,如多發性內分泌腺瘤病Ⅱ型(mutiple endocrine neoplasia type II,MEN II)[3]等。這些家族性嗜鉻細胞瘤呈常染色體顯性遺傳[4],目前已知嗜鉻細胞瘤發生與4種基因有關,它們是 RET原癌基因、VHL基因、SDHD基因和SDHB基因。目前國內外對于嗜鉻細胞瘤患者的基因測試普遍采用DNA直接測序技術。然而,這些疾病的已知致病突變多達100多個,散布在4個基因,如全部測序將耗費大量人力物力。本研究設計開發一種低通量的基因芯片對嗜鉻細胞瘤的基因突變進行識別和診斷,并通過與測序結果比較來評價此芯片的準確性,為臨床大規模應用提供依據。

1 資料與方法

1.1 芯片設計和點樣 根據文獻[5]選擇與嗜鉻細胞瘤相關的 4個基因(RET、VHL、SDHB和SDHD)共87個突變位點。檢測位點全部位于基因外顯子區域,涵蓋與嗜鉻細胞瘤相關的85%的已知變異位點。根據突變位點設計寡核苷酸探針,將探針用點樣液稀釋成50μmol?L-1,用GMS 417點樣儀點樣至經特殊處理過的玻片上。芯片的質量控制包括陽性對照和陰性對照。點好的芯片經水合30 min、0.2%十二烷基硫酸鈉及雙蒸水分別洗脫10 min、干燥等過程完成芯片的制備。

1.2 樣本DNA的制備 取患者外周血5 mL,用酚-氯仿方法提取DNA。嗜鉻細胞瘤患者(6例)來自上海交通大學附屬瑞金醫院高血壓病科。另有29例經基因測序已確定突變位點的DNA樣本由法國巴黎蓬皮杜醫院遺傳中心主任Jeunemaitre教授饋贈(Department of Genetics,H?pital Européen Georges Pompidou,Paris,France)。所有病例結合臨床癥狀、生化指標、影像學檢查、外科手術及病理切片檢查確診為嗜鉻細胞瘤。本研究所有受試者均簽署知情同意書。

1.3 樣本擴增 PCR反應標本的擴增反應采用25 μL混合體系:25 ng DNA樣本,1μmol?L-1引物,200μmol?L-1dNTPs,1.0 mmol?L-1Mg2+,1.5μL DMSO,0.8 g?L-1BSA 和 2.5 U Taq聚合酶在1×Taq聚合酶緩沖體系(Takara,日本)。PCR程序:94 ℃5 min預變性、94 ℃30 S、50℃30 S、72℃45 S,40個循環;72℃5 min(MJ Research PTC-200;MJ Research,美國)。

1.4 雜交反應 雜交步驟如下:將PCR擴增液和陰性、陽性擴增液加入到同一個薄壁管中,98℃熱變性5 min,取出后迅速放入冰盒,在-20℃環境中放置5 min。然后取出基因芯片,做好樣品編號,在雜交艙中加入預雜交液后在42℃環境中靜置5 min,吸除該緩沖液;吸取雜交緩沖液與已變性的PCR擴增產物混合物混勻,將液體全部加入到雜交艙中,42℃雜交30 min。吸除雜交艙中溶液后清洗2次。

1.5 顯色反應 檢測探針采用生物素標記,堿性磷酸酶(AP)催化的NBT/BCIP顯色反應。在雜交艙中加入抗體溶液,室溫放置20 min;吸除雜交艙中溶液,清洗2次;向雜交艙中加入顯色液溶液,42℃避光放置40 min。吸除雜交艙中溶液,小心揭除雜交艙,用蒸餾水沖洗后,置42℃烘干;將顯色載玻片面朝下置于BaiO生物芯片識讀儀片槽上檢測。

1.6 檢測分析 圖像經Array Doctor軟件分析可自動輸出檢測結果。各個信號值均經過背景信號值的校正。芯片中1個檢測位點由相鄰的3個雜交點組成,計算3個雜交點的均值為該檢測位點的信號值,然后將野生型與突變型位點的信號值進行比較以判斷是否存在位點突變。

2 結 果

2.1 芯片雜交質量控制 芯片的掃描結果顯示,陽性參照有明顯的雜交信號,信號強度基本一致,說明芯片雜交、掃描等步驟正常,該陽性參照的雜交信號可作為內對照進行校正(即進行標準化處理)。陰性參照無信號檢出,說明無非特異性雜交。

2.2 芯片雜交和基因測序結果比較 用于芯片檢測的35例DNA樣本均來自散發確診的嗜鉻細胞瘤患者。以基因測序結果為標準,其中29例DNA樣本經基因測序已明確存在1個突變位點,另外6例DNA樣本經測序未發現突變。芯片檢測結果顯示91%的樣本芯片雜交與基因測序結果一致。尤其是這兩種方法對SDHD和RET基因突變位點的檢測符合率為100%(表1,圖1)。另外在6例測序證實無突變的樣本中,芯片檢測結果同樣為陰性。因此,芯片雜交和基因測序的結果十分一致。但是有3例樣本經芯片檢測與基因測序比較仍存在差異(表1)。其中2例測序得到的SDHB基因突變位點(外顯子 6,密碼子 198,核酸 591del C)和(外顯子7,密碼子23,核酸CGC→TGC)芯片未能檢出;另外有1例VHL基因突變位點(外顯子3,密碼子167,核酸499 CGG→TGG),芯片雜交顯示較弱信號,強度僅為野生型信號值的30%,無法將其判斷為特異性雜交,提示雜交條件仍需改進。

表1 基因芯片和基因測序的結果比較

圖1 基因芯片雜交圖圖1為芯片雜交圖,左側為對照,右側為陽性標本雜交結果。右側中左邊紅框內是RET基因的野生型(外顯子11,密碼子634,核酸TGC),右邊紅框內為該位點突變型(外顯子 11,密碼子 634,核酸TGC→GGC突變)。

3 討 論

一些方法,例如傳統的基因序列分析、單鏈構象多態性(SSCP)分析、變性梯度凝膠電泳法(DGGE)、溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、變性毛細血管電泳(DCE)和變性高效液相層析(d HPLC)均可用于檢測基因突變,但這些技術都各有相應的優缺點,例如費用高、耗時及檢測量和可檢測突變類型的有限制等[6-7]。相比而言,基因芯片通過雜交反應檢測嗜鉻細胞瘤相關基因突變較快速、簡便、經濟實用,適用于臨床大量樣本的基因篩查和測試。

本實驗開發的基因芯片用于檢測嗜鉻細胞瘤相關的4個基因(RET、VHL、SDHB和 SDHD)共計87個突變位點,這些位點全部位于外顯子區域,涵蓋與嗜鉻細胞瘤相關的85%的變異位點。本實驗共驗證4個基因29個突變位點,檢測結果證實芯片雜交和基因測序的結果一致,尤其是在對于SDHD和RET基因突變位點的檢測中2種方法符合率為100%。在6例無突變的樣本中,芯片與測序結果一致。

對本芯片研究我們獲得以下體會:在引物探針設計方面,MgCl2濃度的改變對聚合酶鏈反應(PCR)效果的影響較大,擴增片斷較短雜交效果好,以后的實驗應把擴增片斷控制在200 bp以內,位點離生物素標記的引物3'端不宜太近,否則由于擴增片斷,產生空間位阻而影響雜交。并且部分探針間隔臂的長度由16變為30,比增加探針長度效果好,特別是當擴增產物在檢測位點附近序列的二級結構比較復雜時,用這種方法比較好。

本實驗的基因芯片雖然顯示出良好的識別突變位點的效能,但在個別樣本中也顯示其不足之處。由于未收集到所有基因突變類型樣本,用合成的寡核苷酸驗證樣本的突變探針,然而合成的寡核甘酸探針與真實DNA擴增片斷在長度和結構上存在一定的差別,它并不能完全模擬真實DNA擴增片斷與固定在芯片上的特性探針的雜交反應,所以不能保證在以后的應用中能準確檢測出預實驗中沒有的基因型。因此本芯片投入實際應用前,尚需要更多樣本的驗證。

DNA芯片的高密度信息量和平行處理的優點不僅使多基因分析成為可能,而且保證了診斷的高效、廉價、快速和簡便。本研究開發的基因突變檢測芯片經過現有標本的檢驗,具有識別嗜鉻細胞瘤相關基因突變的良好功能,在嗜鉻細胞瘤的基因診斷中可望具有良好的應用前景。

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