急性冠脈綜合征單核細胞中過氧化物酶體增殖物激活受體δ的表達及其與血清基質金屬蛋白酶-9和白細胞介素-10的相關性

楊大春 馬雙陶 楊永健 譚 艷 唐 兵 李 德 張 鑫 朱 峻 陳勁松

(成都軍區總醫院心血管內科,四川成都 610083)

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptors,PPARs)是核受體超家族中的一類配體依賴的核轉錄因子,包括PPARα、δ和 γ3種亞型。PPARδ不僅在細胞生長、分化及組織損傷、修復過程中起重要作用,還參與脂質代謝、轉運及胰島素信號調節作用[1]。大量的實驗表明,PPARδ與脂質代謝有關,可糾正胰島素抵抗和高胰島素血癥。最近還發現PPARδ可以調節血管炎性反應,從而可能影響動脈粥樣硬化的發病過程[2]。但是,PPARδ通過何種機制影響動脈粥樣硬化的發生、發展尚不十分清楚。本研究通過觀察PPARδ在急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)患者周圍血單核細胞的表達及其與血清基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-ase-9,MMP-9)及白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)的關系,探討PPARδ在動脈粥樣硬化發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2008年9月—2009年8月在我院心血管內科住院的急性冠脈綜合征患者52例,發病至入院時間在12 h以內;其中急性心肌梗死(AMI)29例,不穩定型心絞痛患者(UAP)23例;男性38例,女性14例,平均年齡58.9±9.7歲。46例健康對照組的患者為同期門診健康體檢者,其中,男性33例,女性13例,平均年齡 56.7±11.4歲。所有患者知情同意于入院時采取肘靜脈血分離單核細胞及分離血清,空腹12 h后于次日采血測血脂、血糖等。

除外合并以下疾病者:感染、腫瘤、全身免疫性疾病、嚴重肝腎疾病、嚴重高血壓病而血壓未能控制在理想值者、糖尿病及用非固醇類消炎鎮痛藥及免疫抑制藥者。

1.2 方法

1.2.1 材料 淋巴細胞分離液購自美國Sigma公司,TRIzol TM 試劑盒(Invitrogen公司)、逆轉錄試劑盒(Invitrogen公司)、PCRmarker(北京天根生化科技有限公司),PCR擴增引物:GAPDH上游引物5′-GAAGGTCGGAGTCAACGG-3′,下游引物 5′-GCTCAGTGTAGCCCAGGAT-3′(PCR 產物 824 bp);PPARδ 上 游 引 物 5′-TGAGTTCGCCAAGAGC-3′,下 游 引 物 5′-GCCAAGATCACAGGGAC-3′(PCR產物418 bp),由上海博亞生物技術公司合成。MMP-9試劑盒(Amersham Biosciences公司)、IL-10 ELISA試劑盒(上海森雄科技實業有限公司)。

1.2.2 外周血單核細胞分離 采用淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離周圍血單核細胞。取肘靜脈血5 mL加入肝素抗凝管,Hanks液1∶1稀釋混勻。將混勻后的血標本沿試管壁緩慢加入含1.5 mL淋巴細胞分離液的EP管內,室溫下2 500 r?min-1離心15 min。細胞分為上中下3層,在上層與中層分界處有一戒指狀白色細胞環,為單核細胞層,吸出單核細胞層。將細胞濃度調至3×106個?mL-1,用于提取細胞RNA。

1.2.3 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測PPARδ的表達 收集單核細胞,應用Trizol試劑盒提取細胞總 RNA,核酸蛋白定量儀測定 RNA含量,逆轉錄合成cDNA第1鏈,PPARδ及GAPDH PCR反應條件均為:95℃預變性5 min,94℃變性45 s,58℃退火30 s,72℃延伸40 s,重復35個循環,72℃延伸5 min。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統對條帶掃描,軟件分析,分別計算PPARδ與GAPDH吸光度A的比值。

1.2.4 血脂、血糖的測定 采用全自動生化分析儀測定血脂、血糖。

1.2.5 MMP-9、IL-10的檢測 MMP-9及 IL-10測定采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法測定。嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統計學處理 應用SPSS11.5行統計分析,計量資料以ˉx±s表示,組間比較用 t檢驗,相關性采用直線相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般資料 急性冠脈綜合征組(ACS)和健康對照組的一般臨床資料見表1。兩組年齡、性別、體質量指數、血壓、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、血糖值無顯著差異。

表1 兩組患者臨床一般情況比較

2.2 兩組患者血清中 MMP-9、IL-10的情況ACS患者血清MMP-9水平明顯高于健康對照組,IL-10明顯低于健康對照組,P＜0.01,見表2。

表2 兩組患者血清MMP-9及IL-10水平

2.3 周圍血單核細胞中PPARδ的表達 周圍血單核細胞RT-PCR檢測PPARδ表達結果見圖1,可見PPARδ在周圍血單核細胞中有表達,ACS患者PPARδ的表達(0.13±0.08)明顯低于健康對照組(0.34±0.09),P＜0.01。

圖1 健康對照組及ACS組患者周圍血單核細胞單核細胞PPARδ的表達比較(1,3,5為健康對照組,2,4,6為ACS組)

2.4 周圍血單核細胞PPARδ表達與血清MMP-9、IL-10的相關性 分別對ACS外周血單核細胞PPARδ表達水平和血清MMP-9及IL-10進行相關性分析,發現外周血單核細胞PPARδ表達水平與MMP-9成負相關(r=-0.421,P＜0.05),與 IL-10成正相關(r=0.637,P＜0.05),見表3。

表 3 ACS患者周圍血單核細胞 PPARδ表達與血清 MMP-9、IL-10的相關性分析

3 討 論

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種血管壁的病變,目前研究表明其發生除了與內皮損傷、脂質向內皮下轉移并沉積、泡沫細胞形成、血管平滑肌細胞增殖等因素有關外,局部炎性反應在動脈粥樣硬化發生、發展過程中也發揮重要作用[3-4]。研究發現在AS斑塊周圍,存在大量炎性細胞浸潤,如巨噬細胞、淋巴細胞,同時有大量炎性介質的異常表達,如C-反應蛋白、白介素-6、白介素-8及基質金屬蛋白酶等。目前認為ACS發生的主要機制是由于冠狀動脈斑塊的不穩定、破裂、出血、血栓形成,導致急性血流減少或中斷。

冠狀動脈粥樣硬化斑塊纖維帽的降解容易導致斑塊破裂,在ACS的發病機制中起著重要作用,而基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)可降解斑塊局部細胞外基質動脈內膜細胞基質(ECM)從而使纖維帽變薄,導致斑塊的不穩定及破裂[5]。MMPs是一類生物活性依賴于鋅離子、有降解細胞外基質能力的酶系家族,至今已識別的超過20余種。MMPs根據其功能將其分為幾大類:膠原酶、間質溶解素、明膠酶、膜型金屬蛋白酶。MMP-9屬于 MMPs,主要降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原、明膠、纖維連接蛋白等,通過斑塊纖維帽的降解及破裂參與ACS的發病過程。有研究發現,ACS患者周圍靜脈血MMP-9水平明顯增高,且經內科治療癥狀穩定后其水平下降,說明MMP-9可能與斑塊的不穩定性有關系[6]。本研究發現,急性冠脈綜合征患者血清MMP-9明顯高于對照組,也進一步證實MMP-9參與了動脈粥樣硬化不穩定斑塊的形成。

在動脈粥樣硬化過程中,不僅有炎性介質的異常表達,同時,體內具有拮抗炎性作用的細胞因子,在AS斑塊局部抗炎因子存在異常表達。IL-10是具有潛在抗炎作用的細胞因子,它可以抑制多種細胞反應及細胞凋亡,而這些細胞反應對AS斑塊的發展、破裂及血栓形成起著重要作用[7]。IL-10是由激活的淋巴細胞、單核/巨噬細胞和肥大細胞產生的,它有多種抗炎性能:抑制轉錄因子核因子κB,進而抑制細胞因子、趨化因子的產生;抑制細胞黏附分子產生;抑制基質金屬蛋白酶分泌,刺激基質金屬蛋白酶抑制劑生成;抑制組織因子及纖維蛋白原的表達,防止血栓形成,在抑制ACS的發生發展中可能發揮重要作用[8]。本研究顯示,ACS患者血清中IL-10水平明顯低于對照組,提示在不穩定斑塊的發生、發展過程中,抗炎因子的拮抗作用減弱可能也是其機制之一。表明致炎作用與抗炎作用的失衡可能是不穩定斑塊的形成的重要原因。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptors,PPARs)是一類由配體激活的核轉錄因子,屬Ⅱ型核受體超家族成員之一。機體內存在3種過氧化物酶體增殖活化受體(PPAR)亞型 ,即 PPAR-γ,PPAR-α和 PPAR-δ(也稱為PPAR-β),組成了核受體亞家族。PPARs與視黃酸X受體(RXR)結合形成異二聚體,與PPARs反應元件(peroxisome proliferator responsive element,PPRE)結合后調節基因轉錄,從而發揮一系列生物學效應[9]。既往研究發現,PPARs 3種受體亞型都具有抗血管壁炎性反應的作用[1]。在與動脈粥樣硬化相關的脂質代謝研究中,有研究發現PPARδ的激動劑GW501516在人巨噬細胞系(THP21)、皮膚成纖維細胞(IBR3N)、腸細胞(FHS74)中能促進膽固醇轉運;在鼠與非人靈長類能夠提高膽固醇逆向轉運子ACBA1(ATP結合盒轉運子),促進膽固醇逆向轉運,升高循環中的高密度脂蛋白(HDL)水平[10],減少具有致動脈粥樣硬化的小而密的 LDL的作用[11]。Graham等[12]給予LDLR/小鼠高脂飲食,同時分別給予PPARδ特異的激動劑GW610742或藥物載體,GW610742處理組動脈粥樣斑塊損傷面積減少達50%。但激動劑對血漿脂蛋白組成影響很小。GW610742處理組主動脈的炎性分子如MCP-1、TNF-α、ICAM-1表達下調,腹膜單核巨噬細胞CD36、TNF-α表達也下調。血漿中炎性因子如 MCP-1、RANTES、IL-12和TNF-α的水平降低。Barish[13]研究發現,PPARδ可通過誘導G蛋白信號基因調節子(RGS)的表達,抑制趨化因子的信號轉導,從而抑制動脈粥樣硬化的形成。本研究發現,ACS患者周圍血單核細胞PPARδmRNA表達明顯低于對照組,且其表達量與炎性介質MMP-9成反比,與IL-10成正比。提示PPARδ可能通過抑制MMP-9的表達,促進IL-10的表達,調節抗炎因子與炎性介質之間的比例,從而發揮抑制動脈粥樣不穩定斑塊形成的作用。表明PPARδ在急性冠脈綜合征的發病中可能具有重要作用。

PPARδ通過何種機制調控炎性介質與抗炎因子的表達及維持其正常比例,目前尚不清楚,有待研究。由于本研究樣本量較少,尚需進一步積累大樣本資料進行深入研究。

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