過氧化物酶體增殖因子活化受體γ在大腸癌中的表達及意義

馬元華 鄭發壽 樊曉明 張友元

(復旦大學附屬金山醫院消化科,*病理科,上海 200540)

過氧化物酶體增殖因子活化受體(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPAR-γ)是一類由配體激活的核轉錄因子,屬核激素受體超家族成員,在脂代謝和糖代謝中起重要的調節作用[1]。近年來發現PPAR-γ在多種腫瘤細胞(如乳腺癌、胃癌、肺癌等)中表達,其經 PPAR-γ的配體作用后能誘導上述細胞的分化和凋亡。增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是DNA聚合酶δ的輔助蛋白,對DNA的復制和細胞的增殖有重要作用,PCNA在增生細胞中的表達有明顯的周期性,是一個評價細胞增殖的較好的指標。本實驗通過研究PPAR-γ、PCNA在不同類型大腸癌中表達,探討其與大腸癌病理特征之間的關系,以及在大腸癌細胞增殖分化中的作用。

1 資料與方法

1.1 標本來源 本研究56例大腸癌標本均取自復旦大學附屬金山醫院普外科2004—2005年接受手術治療的患者,全部經病理檢查確診,均帶有癌旁正常組織。其中男性31例,女性25例;年齡32～86歲,中位年齡61歲。

1.2 免疫組織化學染色 術后立即取組織標本,經4%福爾馬林浸泡固定后,脫水、透明、浸蠟包埋,制成4μm厚連續切片,常規脫蠟至水。免疫組織化學檢測采用En vision兩步法,一抗兔抗人PPAR-γ多抗購自武漢博士德生物工程有限公司,工作濃度為1:50;PCNA單抗購自福州邁新生物技術開發有限公司,工作濃度為1:100;PBS代替一抗作陰性對照,37℃孵育2 h。充分洗滌后,滴加購自上海長島抗體診斷試劑公司的即用型羊抗鼠、兔的二抗試劑,37℃孵育30 min。然后用DAB顯色,以胞內出現棕黃色顆粒為陽性表達。

1.3 計算方法 根據著色程度和區域大小作PPAR-γ半定量分析。著色程度分為4級:強(++)、中(+)、弱(±)和無著色(-)。著色區域也分為4級:0、＜30%、30～60%和＞60% 。以所有著色程度為“++”及染色范圍＞30%的癌組織為PPAR-γ高表達,其余為低表達。

采用雙盲法隨機選取5個視野,在高倍鏡(×200)下計數1000個細胞中的 PCNA的陽性細胞數,PCNA指數=陽性細胞數/1 000。

1.4 統計學方法 采用t檢驗和χ2檢驗等對數據進行處理。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PPAR-γ在不同組織中的表達 PPAR-γ在大腸癌組織中均有不同程度的表達。在大腸癌病理組織切片中,細胞核周圍和細胞漿出現棕黃色顆粒。在癌旁正常大腸組織內的陽性細胞主要是大腸腺細胞,正常大腸組織中的陽性細胞較少,只在零星的大腸腺組織內才可見到。大腸癌組織中的陽性細胞主要是增生或惡變的大腸腺細胞,見圖1。癌旁正常黏膜組織的陽性率為21.4%,而大腸癌組織為69.6%,兩者有極顯著性差異(P＜0.001),見表1。

圖1 免疫組織化學示大腸癌PPAR-γ呈陽性,癌旁組織呈陰性(×100)

表1 PPAR-γ在不同組織中的表達(例)

2.2 PPAR-γ的表達與大腸癌病理特點的關系將56例大腸癌病例的切片分別按性別、年齡、腫瘤位置、分化程度、浸潤深度、有無淋巴結轉移和Dukes分期進行分組,比較各組中的PPAR-γ表達的差異,見表2。

表2 PPAR-γ的表達與大腸癌病理特點的關系

PPAR-γ臨床特點 例數高表達 低表達 P值Dukes分期0.039 A+B 26 14 12 C+D 30 25 5淋巴結轉移0.048 N0 22 12 10 N1+ 34 27 7浸潤程度0.030 T1+2 21 11 10 T3+4 35 28 7

2.3 PPAR-γ的表達與PCNA-指數顯著相關(P＜0.001)。PPAR-γ高表達的大腸癌組織,其PCNA指數亦顯著增加 見表3。

表3 PPAR-γ的表達與 PCNA-指數的關系

3 討 論

Isseman等[2]于1990年首先在老鼠身上發現PPAR。它可以作為許多疾病的治療靶點,應用于肥胖、Ⅱ型糖尿病、高脂血癥、動脈硬化和腫瘤的防治和治療等。在體內,PPAR與配體結合而被激活后與維甲酸類受體X(RXR)或糖皮質激素受體形成異二聚體 ,再與位于其上游的特異性DNA序列結合使靶基因活化,從而發揮其轉錄調控的作用。PPAR還可通過干擾核因子κB(NF-κB),通過輔助因子的抑制作用以及影響蛋白質間的相互作用干擾某些信號轉導的功能。PPAR存在 3個亞型(α、β和γ),其中PPAR-γ主要分布于脂肪組織、胃腸道及造血干細胞中,參與脂肪的形成和代謝、炎性反應、細胞的分化和凋亡等生理或病理過程。PPAR-γ作為前列腺素和脂肪酸下游的轉錄介質,其激活可增加大腸中β-catenin的濃度,后者與腫瘤的形成及轉移有關[3]。

配體活化的PPAR-γ能抑制細胞生長、促進細胞分化。Altiod等[4]認為PPAR-γ通過下調PPA蛋白激酶,抑制細胞生長轉錄促進因子E-F/DP而發揮作用。Schaefer等[5]則認為PPAR-γ抑制劑可下調微管蛋白水平,從而抑制細胞周期循環及其凋亡,并促進大腸癌細胞分化。PPAR-γ能調節細胞增殖和炎性反應。Su等[6]發現結腸癌上皮細胞高表達PPAR-γ蛋白。本研究顯示 ,大腸癌組織中PPAR-γ的陽性率顯著高于癌旁正常黏膜組織,提示PPAR-γ的高表達可能是大腸癌發生的分子標志。這與鐘蕓詩等[7]的研究結果相一致。他們證實,PPAR-γ在人胰腺癌組織中表達上調 ,可能與胰腺癌的發生有關。本研究證實PPAR-γ的表達在大腸癌Dukes分期的“C+D”期顯著高于“A+B”期,且隨著病程的進展,PPAR-γ的表達進一步增高,其分化程度越低、惡性程度越高則PPAR-γ的表達就越高、越易被檢出,從而有可能為臨床療效觀察、病情檢測和預后判斷提供一個新的指標。穿透漿膜層癌腫組織的PPAR-γ陽性率高于未穿透漿膜層者;在有淋巴結及肝轉移癌腫組織的PPAR-γ表達亦顯著高于相應無轉移者。說明 PPAR-γ的高表達不僅與大腸癌的發生相關 ,還與癌腫的浸潤、轉移有關 ,同時也預示了患者的不良預后。

有流行病學資料顯示進食高脂肪食物與結腸癌發病有關,而前者正是PPAR-γ的天然激動劑。給與C57BL/6J-APCMin/+鼠曲格列酮和羅格列酮,可分別使結腸癌的發生率增加4.25倍和1.83倍;并且可使腫瘤的體積增大。這與給與 C57BL/6JAPCMin/+鼠高脂飲食后的結果相似,可見高脂飲食可能就是通過PPAR-γ而導致結腸癌發生的[8]。

PCNA是一種分子量為33.36 KD的核蛋白,是細胞核合成DNA所必須。PCNA在DAN合成前G1末期升高,S期達到最大值,G2和M 期明顯下降。本研究結果顯示PPAR-γ高表達組的PCNA指數顯著高于低表達組,說明PPAR-γ促進了大腸腫瘤細胞的增殖。而腫瘤細胞的增殖是其浸潤轉移的基本條件,這也證實PPAR-γ確實與大腸癌的浸潤、轉移有關。

1 Berthiaume M,Sell H,Lalonde J,et al.Actions of PPAR gamma agonism on adiposetissue remodeling,insulin sensitivity,and lipemia in absence of glucocorticoids[J].Am J Phy siol Regul Integr Comp Physiol,2004,287(5):1116-1123.

2 Isseman I,Green S.Activation a member of the steroid hormone receptor superfamily by peroxisome proliferators[J].Nature,1990,347:645-650.

3 Theodoropoulos G,Papaconstantinou I,Felek ouras E,et al.Relation between common polymorphismsin genes related to inflammatory response and colorectal cancer[J].World J Gastroenterol.2006,12(31):5037-5043.

4 Altiod S,Xu M,Spiegelman BM.PPARγinduces cell cycle withdrawal:inhibition of E2F/DP DNA-binding activity via down-regulation of PP2A[J].Genes Dev,1997,11(15):1987-1998.

5 Schaefer KL,Takahashi H,Morales VM,et al.PPARgamma inhibitors reduce tubulin protein levels by a PPARgamma,PPARdelta and proteasome-independent mechanism,resulting in cell cycle arrest,poptosis and reduced metastasis of colorectal carcinoma cells[J].Int J Cancer,2007,120(3):702-713.

6 Su CG,Wen X,Bailey ST,et al.A novel therapy for colitis utilizing PPAR-gamma ligands to inhibit theepithelial inflammatory response[J].J Clin Invest,1999,104(4):383-389.

7 鐘蕓詩,姚禮慶,孫益紅.過氧化物酶體增殖因子活化受體δ(PPARδ)在大腸腺癌、癌中的表達及其意義[J].中國臨床醫學,2004,11(6):1040-1042.

8 Saez E,Tontonoz P,Nelson MC,et al.Activators of the nuclear receptor PPARgamma enhance colon polyp formation[J].Nat Med,1998,4():1058-1061.