人乳頭狀瘤病毒感染與宮頸癌的研究進展

周 瑾 吳清明綜述 黃國香審校

宮頸癌是造成目前世界婦女死亡的主要疾病之一，據世界衛生組織統計，全世界每年有25萬婦女死于宮頸癌，約50萬宮頸癌新發病例[1]。宮頸癌病因研究一直處于探索階段，自Laverty 在電鏡中觀察到子宮頸癌活檢組織中存在人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)顆粒，Zur Hausen等提出人乳頭狀瘤病毒與子宮頸癌發病可能有關的假說[2]以來，國內外學者對子宮頸癌與HPV感染關系進行了大量研究，發現HPV感染是宮頸癌的主要流行因素，90%以上宮頸癌是由HPV感染引起[3]。許多專家關于宮頸癌發病的病因越來越傾向于多因素論，認為宮頸癌的病因因素還包括了多孕、多產、性行為、性傳播性疾病、性激素、吸煙、口服避孕藥等[4，5]，其中HPV感染是子宮頸癌的首要病因。

1 HPV的結構分型及感染

1.1 HPV的結構與分型

HPV屬多瘤空泡病毒科家族，是一組體積較小的環狀雙鏈DNA病毒，由DNA核心和蛋白衣殼組成的無包膜病毒[6，7]。基因組有8～10個開放讀碼框架(ORF)，包括3個功能區域:①早期區(E)含有8個開放讀碼框，約有450 kb組成，其編碼產物依次為E6、E7、E1、E8、E2、E4、E3和E5。參與病毒DNA復制、轉錄和細胞轉化，是維持病毒復制、編碼病毒蛋白和細胞內病毒高拷貝數的基因。其中E1和E2編碼蛋白可特異結合LCR特定的序列，調節其他基因的轉錄； E4編碼蛋白調節病毒的復制和成熟，并具有破壞宿主細胞骨架的作用。E6和E7基因分別編碼含150個氨基酸和100個氨基酸的病毒原癌蛋白，與病毒復制的調控及細胞惡性轉化密切相關。②長控制區(LCR)，又稱為上游調控(URR)或非編碼區(NCR)，約由1 000 bp組成，位于L1和E6之間，包含DNA復制起始，增強元件和轉錄增強序列，是主要的病毒轉錄調控區[8]，通過與轉錄因子的相互作用，調節早期區基因的轉錄，與病毒復制轉錄的調控有關。③晚期區(L)，位于53和89基因圖單位之間，編碼2個結構蛋白，即主要核殼蛋白(L1)和次要核殼蛋白(L2)，L1具有高度保守性，是主要的種特異性抗原，具有較強的免疫原性，能刺激機體產生中和抗體IgG、IgA，可使機體免受相應病毒的攻擊。而L2具有特異性，反映HPV抗原的多態性[6，9]。

DAN序列分析發現HPV至少有100多個基因型，將對人類生殖道黏膜有感染力的有30多種[3，10]。根據其致病力的大小，分為高危型和低危型兩類:①低危型:6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81等，主要引起生殖器疣；②高危型:16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73和82等[11]，最主要的有5型：16、18、31、33、45[3，12]，主要引起宮頸癌及宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)。宮頸鱗癌(SCCA)主要感染HPV16型，HPV18則主要與宮頸腺癌(AC)有關[6，9]。

1.2 HPV感染

宮頸癌是感染性疾病，已證實HPV是宮頸癌的主要致病因子[13，6]，即HPV感染是子宮頸癌發生的必要條件[2，4]，特別是高危型HPV感染與宮頸癌的發生有明確關系。感染高危型HPV最危險因素是性伴侶的數目，性伴侶越多感染幾率越大，另外吸煙和多產也會增加感染高危型HPV的機會[12]。高危型HPV持續感染或病毒清除會導致宮頸病變的進展或消退。大多數研究者認為，HPV負荷量與宮頸病變進展有一定關系[14]。Jo L.K.Cheung等[15]對92例感染HPV52婦女觀察發現，宮頸病損程度與HPV52病毒載量成正相關。但HPV感染與宮頸癌的臨床分期和組織學分級均無相關性[16]。

HPV首先經子宮上皮基底層細胞和附基底層細胞感染。在子宮頸局部的HPV主要侵襲鱗狀上皮和柱狀上皮交接部和主要由菲薄的未成熟的基底層和附基底層細胞組成的移行帶(TZ)。當分裂活躍的上皮細胞被感染后，病毒以裸露的DNA殘基形式潛伏于細胞核內，病毒DNA復制與正常細胞分裂同步進行。此時，HPV感染的細胞形態仍正常，因它不產生完整病毒，故潛伏性感染的患者可僅攜帶病毒而不感染他人[9]。對于約80%的感染者，感染是暫時的，并不發展為CIN，病毒在6～8個月內會被清除。另外20 % 感染者體內的病毒不會清除，感染持續存在，最終導致CIN 的形成，或從CINⅠ(輕度非典型增生)發展到CINⅢ(重度非典型增生)甚至宮頸癌。但若感染高危型HPV，免疫功能強的患者，宮頸癌的發生率較低。高危型HPV感染產生的中和抗體反應能保護這些婦女免于發展成為CIN患者。當患者免疫功能減退或HPV侵襲力較強時，感染的上皮細胞產生大量新病毒，引起感染擴散和上皮細胞的不典型增生。低危型HPV感染也可導致CINⅠ及CINⅡ，然而這些病損從不或極少發展為CINⅢ級和宮頸癌[9，17]。CIN是1個有時空概念的病變，宮頸上皮不典型細胞可以逆轉成正常細胞，也可以轉變為浸潤癌，這些變化取決于不典型增生細胞的生物學行為，或正常宮頸細胞感染HPV后的損傷程度[18]。

目前，HPV感染患者逐漸年輕化，25歲以下女性中HPV陽性率相對較高，而30歲以上者相對較低[19]。由于HPV感染的年輕化，使宮頸癌的發生率呈上升趨勢，其中80%以上發生在發展中國家[3]。因此，對宮頸上皮內瘤變(CIN)、HPV 感染的處理，是防治宮頸癌的關鍵[19]。

2 HPV感染與宮頸癌發病機制的關系

在HPV感染的上皮細胞中，環狀HPV病毒通過在El、E2的ORF斷開，并線性化插入至人體上皮細胞染色體上[6，20]，而E6、E7則整合于宿主細胞中起作用。整合事件對宿主基因組是隨機的，對病毒基因組是特異的。HPV環鏈最常見在E1或E2的開放讀碼框內斷裂，并導致部分或全部E4、E5、L1和L2喪失，而僅有E6和E7整合入宿主DNA[20]。整合也發生在端粒酶催化亞單位(hTERT)的促進子和上游區域，且整合部位毗鄰病毒的增強子，可能增強hTERT表達[21]。在良性或癌前病變中HPV一般為游離型感染，而在惡性腫瘤中則為整合型感染[6，21]。

HPV致癌大致有如下幾個機制:①早期基因的表達激活細胞的增殖，病毒基因組與宿主染色體發生整合，E1、E2基因被破壞，從而導致E6、E7基因的表達失去控制，呈持續表達和過度表達。E6和E7是強力的細胞轉化和致癌基因。②病毒基因組的整合可能會激活原癌基因。如c-myc、C-fos、C-jun等，致使細胞惡性轉化。石玲玲等[22]研究發現HPVl6/18陽性患者Pinl，CyclinDl的陽性表達率較高。在宮頸癌發生發展過程中，肽基脯氨酰順反異構酶Pinl過表達及其功能異常所致Cyclin D1過表達是Pinl促宮頸上皮細胞轉化增殖的分子機制之一。Pinl與HPV均可通過Ras途徑而激活C-jun，經C-jun信號通路激活CyclinDl的啟動子促進CyclinDl轉錄，并通過誘導CyclinDl構型改變阻止CyclinDl從胞核內遷移至胞漿降解，促進宮頸上皮細胞轉化增殖。③HPV與抑癌基因：E6、E7蛋白分別與細胞內腫瘤抑制物p53和Rb結合是HPV致癌的重要機制。p53是重要的基因轉錄激活物，正常宿主細胞DNA受損時，p53基因活化，促使細胞分裂停滯于G1和G2期，以便DNA修復和防止基因突變；高危型HPVE6蛋白與野生型p53兩者極易結合使p53快速降解、失活，封閉了p53功能，解除細胞增殖抑制，使細胞過度增殖而導致腫瘤的發生。Rb是另1種重要的抑癌基因，正常低磷酸化的Rb蛋白可與E2F結合而抑制基因表達。Ras相關區域家族1A(RASSFIA)基因是新近克隆出來的1種腫瘤抑制基因，調節細胞周期和細胞凋亡。燕杰等[16]研究發現，RASSFIA基因的LOH陽性率在HPV感染陽性組明顯高于陰性組，證明HPV感染與PASSFIA的LOH共同作用在宮頸癌的發展過程中。RASSFIA基因的改變是宮頸癌發生過程中的較晚期事件。④HPV與端粒酶:端粒酶是使端粒延伸的反轉錄DNA聚合酶，它的過度表達在細胞永生化和人類惡性腫瘤的發生中起關鍵作用[6，21]。正常情況下端粒酶不表達，宮頸癌組織中端粒酶陽性率達92%，且多為強陽性。HPV感染與端粒酶激活有關，HPVE6/E7的轉錄基因已經證明可以誘導端粒酶的活性和永生化。端粒酶的激活是高危型HPV感染子宮頸上皮后有CIN向癌轉化的過程中相當關鍵的步驟[6]。⑤HPV與免疫:HPV感染機體后機體免疫系統會受到影響。高危型HPV感染后，NK/T細胞活性降低，局部LC數目減少，故發生癌變的危險性增大；與此同時，HPV的結局與機體免疫狀態有很大關系，生殖道黏膜免疫系統對HPV的防御反應主要是局部體液免疫。在動物模型中，體液免疫可控制HPV的復發及感染速度[6，21]，并且被病毒感染的宿主細胞可通過自殺機制，用以阻止新的病毒顆粒復制[6，9]。細胞免疫在調節HPV感染反應中起重要作用，HPV只有逃避宿主細胞的調控才可以繼續復制。造成HPV相關腫瘤免疫逃逸的機制有:①E1蛋白的17-37位氨基酸與p48結合，阻斷a-IFN介導的信號轉導，從而抵抗干擾素的抗病毒、抗腫瘤作用。②HLA-Ⅰ類分子抗原表達下調、缺失或其基因結構的改變，導致對癌抗原提成、識別和殺傷作用發生障礙。③MCH-I類分子表達異常。在HPV相關的原位轉移、復發的宮頸癌中，高頻出現主要組織相容性復合體-I(MCH-I)類分子的等位基因缺失，MCH- I類分子下調可使這些癌細胞逃避機體的免疫監視。

3 HPV的檢測方法

隨著HPV與子宮頸癌病因關系廣泛受到重視，HPV檢測方法也在不斷地改進，如細胞學檢查、斑點印跡法、核酸雜交、CPR和雜交捕獲法、生物芯片技術等。

細胞學檢測雖具有很高的特異度，但敏感性不高[6，23]；組織學檢測在HPV陽性細胞學正常的個體中很少發現病毒膜抗原[24]；血清學檢測血清中的抗體滴度較低，很難檢測到。 HPV基因組檢測是目前應用較多的檢測方法，包括：① PCR檢測:是目前較好的HPV 檢測方法，具有很高的靈敏度。通過計算機輔助設計HPV各亞型引物后，便能夠有效特異地擴增相應的亞型。可通過多種方法驗證HPV型別。② 核酸雜交檢測:核酸雜交的特異性和靈敏度顯著高于傳統檢測方法，并且還可應用特異性針對HPV進行分型。目前已有多種用于HPV DNA的核酸檢測方法如斑點雜交，原位雜交，雜交捕獲DNA序列等。雜交捕獲(HC)是聯合應用高效的液相雜交法和敏感的化學發光信號擴增系統進行檢測包括雜交捕獲管試驗(HC-Ⅰ)和第二代雜交捕獲試驗(HC-Ⅱ)2種方法。HC-Ⅰ可檢測9種高危型HPV，包括16、18、3l、33、35、45、5l、52、56；HC-Ⅱ擴大到對13種高危型HPV，包括16、18、3l、33、35、39、58、59、68均可進行定性定量檢測。具有靈敏度高、特異性好、重復性和客觀性強等優點，特別適合大規模的人群篩查，目前較為理想的檢測方法[24，25]。③生物芯片技術：是新興的高度集成化的分析和研究技術，在PCR檢測法基礎上，結合了光學、化學、分子生物學等多學科手段，通過芯片制備、樣品標記、雜交反應和結果檢測等過程得出結果。基因芯片可以確切將HPV分型，和判斷多重感染。基因芯片技術在HPV的分型診斷中具有獨特的優勢，是理想方法。其特點為高通量、敏感性高、特異性強，但價格昂貴[25]。

4 HPV的基因治療研究進展

鑒于HPV感染與宮頸癌發生密切相關，研發HPV疫苗現已成為研究熱點。HPV疫苗分為預防性疫苗和治療性疫苗兩類[26]。

⑴ HPV預防性疫苗:主要以HPV病毒的結構蛋白質形式存在，一般由病毒衣殼蛋白L1或L1+L2組成，在細胞內可自我組裝成空心病毒樣顆粒(VLPs)。它具有與完整病毒相同的抗原空間表位，可激發機體的CD4+ 淋巴細胞介導的體液免疫反應，刺激機體產生保護性中和抗體；可阻斷HPV感染皮膚和黏膜。VLPs作為預防性疫苗在美國和拉丁美洲已開展臨床Ⅲ期實驗。

⑵ HPV治療性疫苗：可清除由HPV感染所引起的腫瘤殘存病灶、宮頸不典型增生(CIN)及生殖器尖銳濕疣，阻斷低危型病變向高危型及癌癥的轉變過程。有多肽疫苗、融合蛋白疫苗、嵌合疫苗、DNA疫苗和RNA疫苗等。肽段疫苗最主要的代表為E7肽段疫苗，采用HLAA0201結合肽，主要是E7蛋白第11～20和86～93氨基酸2段分子肽段，臨床試驗證實多肽疫苗對癌前病變及宮頸癌有一定的治療效果；嵌合蛋白疫苗L2E7E6是由HPV16型早期蛋白和晚期蛋白組成，動物實驗顯示其能有效的抑制腫瘤的形成。融合蛋白疫苗:由HPV早期蛋白相互融合或早期蛋白融合有其它蛋白，能更好的激發對機體免疫系統的免疫功能。DC疫苗是HPV16/18E7抗原導入成熟樹突狀細胞融合而成的，有學者[8]觀察，DC疫苗用于宮頸癌ⅠB、ⅡA根治術后患者，可使CD4+T細胞和CD8+T細胞增高，并產生DC疫苗抗體，無明顯毒性反應。DNA疫苗常采用病毒載體或其他載體攜帶HPV早期基歷，大多進行到臨床試驗階段。RNA疫苗具有RNA復制子可自我復制，RNA疫苗的臨床研究目前還未見報道[26]。

總之，宮頸癌的研究在目前已經取得重大進展。隨著新技術、新醫療設備的出現，宮頸癌多方面、有計劃、有目的地進行術前、術后綜合治療是研究的重點，而病因分子生物學研究、宮頸癌瘤苗的研制、基因工程的發展等領域也是未來關于宮頸癌研究的重點。

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