大腸桿菌細胞固定化方法研究進展

在過去的30多年，人們開發(fā)了多種原核和真核表達系統(tǒng)生產(chǎn)外源重組蛋白。和其它表達系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、表達水平高、操作容易和成本低等優(yōu)點，成為表達外源蛋白最常用的表達系統(tǒng)之一。

近年來,隨著固定化細胞技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究者關(guān)注于固定化大腸桿菌細胞。固定化大腸桿菌細胞具有如下優(yōu)勢：首先，相較于游離細胞，固定化細胞在催化反應(yīng)過程中，其質(zhì)粒更加穩(wěn)定，目的基因產(chǎn)物的活力較高[1,2]，產(chǎn)物易于分離純化；其次，和其它重組菌相比，大腸桿菌更易操作、發(fā)酵成本低、可快速大規(guī)模催化反應(yīng)物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物[3]。自1959年Hattori首次將大腸桿菌細胞吸附在樹脂上實現(xiàn)了大腸桿菌細胞固定化以來，固定大腸桿菌活細胞或稱為固定化增殖大腸桿菌細胞的研究工作相繼展開。

目前，固定化重組大腸桿菌細胞已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于小分子藥物生產(chǎn)、工業(yè)廢水處理、能源開發(fā)以及大宗化學(xué)品生產(chǎn)等方面[4,5]。

1 大腸桿菌細胞固定化方法

從理論上講，任何一種限制細胞自由流動的技術(shù)，都可以用于大腸桿菌細胞的固定化。但目前使用最普遍的固定化大腸桿菌細胞的方法是包埋法和吸附法。

1.1 包埋法

包埋法的原理是將微生物細胞截流在水不溶性的凝膠聚合物孔隙的網(wǎng)絡(luò)空間中或埋于半透膜聚合物的超濾膜內(nèi)，通過聚合作用、離子網(wǎng)絡(luò)形成、沉淀作用，以及通過改變?nèi)軇囟取H值來阻止細胞的泄漏，同時能讓底物滲入和產(chǎn)物擴散出來。目前應(yīng)用最為廣泛的是凝膠包埋法固定大腸桿菌細胞，其特點如下[6]：

(1)操作簡便。將大腸桿菌細胞與單體或聚合物一起聚凝，細胞被包埋在形成的聚合物中。

(2)條件溫和。可選用不同的聚合物載體、不同的包埋系統(tǒng)和條件，以保持大腸桿菌的酶催化活性。

(3)穩(wěn)定性好。大腸桿菌細胞不易滲漏。

(4)細胞容量高。大腸桿菌細胞在聚合體中含量可高達50%～70%。

(5)可以反復(fù)利用。與液體發(fā)酵相比，包埋的大腸桿菌生產(chǎn)周期短、產(chǎn)物分離方便、能耗低、設(shè)備投資少且可大大改善操作條件。

20世紀80年代末，趙景聯(lián)[7]利用海藻酸鈉包埋重組大腸桿菌細胞合成了高純度的γ-氨基丁酸，間歇反應(yīng)轉(zhuǎn)化率可達100%。隨后，由英才等[8]利用固定的大腸桿菌AS1.881合成了L-天門冬氨酸，固定化菌株在pH值9.0、40℃的條件下反應(yīng)48 h，產(chǎn)物量達到最高。張曉梅等[9]通過固定化重組大腸桿菌JM109(pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇，成功地克服了底物抑制作用，產(chǎn)率大幅提高。

包埋法的優(yōu)點使其在大腸桿菌細胞固定化研究中占有較大的優(yōu)勢，但包埋法仍存在一些不足，如包埋材料對細胞的毒性作用、材料本身阻礙大分子底物和氧的擴散、使用過程中的雜菌污染等，這些還需要進行更深入的研究。

1.2 吸附法

吸附法又稱載體結(jié)合法，是利用帶電的微生物細胞和載體之間的靜電、表面張力和粘附力等作用，而使微生物細胞固定在載體表面和內(nèi)部的方法。該方法操作簡單、大腸桿菌細胞活力損失小。

Torre等[10]分別利用多孔玻璃、網(wǎng)狀聚氨酯、合成海綿吸附大腸桿菌JM109/pBB1催化阿魏酸鹽合成香蘭素，發(fā)現(xiàn)合成海綿吸附后，催化效果最好，香蘭素的終濃度達到0.080 g·L-1，產(chǎn)率達0.019 g·L-1·h-1。

吸附法操作簡單、成本較低，但所固定的大腸桿菌數(shù)目受所用載體的種類及其表面積的限制，并且大腸桿菌與載體作用力小，易脫落，只有通過與其它材料混合使用或者用交聯(lián)劑進行交聯(lián)，才能得到更廣泛的應(yīng)用。

2 大腸桿菌細胞固定化載體

理想的大腸桿菌細胞固定化載體應(yīng)具備以下條件：機械強度高、壽命長、容量大、價格低、性質(zhì)穩(wěn)定、不易被生物降解、固定化過程簡單、常溫下易于成形；對于固定化活體細胞，固定化過程及固定化后對微生物無毒，生化及熱力學(xué)穩(wěn)定性好，基質(zhì)通透性好，沉淀分離性好，具有惰性，不干擾生物分子的功能。此外，還要根據(jù)具體的使用環(huán)境，來選擇大腸桿菌細胞固定化載體，或者優(yōu)化載體性能。目前應(yīng)用較多的大腸桿菌細胞固定化載體有葡聚糖類、海藻酸鹽、聚丙烯酰胺和聚乙烯醇、無機載體等。

2.1 葡聚糖類

應(yīng)用較廣的葡聚糖類材料主要有瓊脂糖凝膠、卡拉膠、黃原膠，它們的生物相容性良好，具有較大孔隙，可以允許高分子物質(zhì)的擴散，并且不帶電荷，不會與底物或產(chǎn)物形成離子鍵，不影響大腸桿菌生長，因此成為近年來研究最熱門的固定化載體材料之一[11]。

童群義等[12]用PVA-卡拉膠混合載體固定化大腸桿菌-酵母菌混合體系生產(chǎn)谷胱甘肽，產(chǎn)率達446.7 mg·L-1，成功降低了生產(chǎn)成本，固定化細胞連續(xù)使用10批次，其酶活力無顯著下降，也未見明顯的膨脹和破碎。Trelles等[13]固定化EscherichiacoliBL21催化合成腺嘌呤和次黃嘌呤核苷，分別對比了海藻酸鈉、瓊脂、瓊脂糖和聚丙烯酰胺包埋材料對產(chǎn)率的影響，發(fā)現(xiàn)在連續(xù)進行30批次反應(yīng)后，相較于其它材料，固定在瓊脂糖上的大腸桿菌細胞在前26批次反應(yīng)均沒有酶活損失；在相同的時間內(nèi)，1 g瓊脂糖固定化菌株能合成182 g腺苷，相當于73 g游離菌的產(chǎn)率；并且固定化大腸桿菌細胞在4℃存放6個月后酶活沒有明顯的下降。

但是葡聚糖類材料強度較低，容易溶脹、破碎，因此若要工業(yè)化應(yīng)用，還需要在提高機械強度、改善力學(xué)性能等方面進一步探索，如與某些人工高分子材料混合使用，來提高其強度。

2.2 海藻酸鹽

海藻酸鹽是一種天然線性高聚物固定化介質(zhì)，其二價以上的鹽(Ca2+、Al3+) 為水不溶性鹽，因此可形成耐熱的凝膠，而且其易與蛋白質(zhì)、明膠等多種物質(zhì)共溶，并可與大腸桿菌混合形成均勻的懸浮液，具有機械性能較高、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、無毒、包埋效率高且價格低廉等優(yōu)點，因此近年來應(yīng)用廣泛。

Lu等[14]用海藻酸鈉固定化E.coliBL21-P450-BM3細胞，成功催化吲哚合成靛藍，在pH值7.0、50℃時，合成靛藍的活性達到了游離細胞的94%，并且固定化細胞重復(fù)使用6批次后，產(chǎn)率沒有明顯的下降。Birgisson等[15]用海藻酸鈣固定化重組大腸桿菌細胞水解柚皮苷來生產(chǎn)α-L-鼠李糖，在50℃完全降解7.9 mmol·L-1的柚皮苷速率能達到1 mL·min-1，并且固定化細胞能連續(xù)使用3 d，第4 d降解能力下降10%～15%。牛衛(wèi)寧等[16]用海藻酸鈣包埋重組大腸桿菌E.coliJM109 (pBR322-MAT)細胞催化合成S-腺苷蛋氨酸，對比研究了聚乙烯醇和海藻酸鈣的包埋效果，發(fā)現(xiàn)用海藻酸鈣包埋重組大腸桿菌細胞合成S-腺苷蛋氨酸產(chǎn)率更高，包埋后小球的力學(xué)性能和傳質(zhì)效率較好。

然而在細胞生長所必需的高濃度磷酸鹽和Mg2+、K+、Na+等陽離子溶液中，海藻酸鈉與CaCl2形成的海藻酸鈣凝膠小球不穩(wěn)定，容易破碎和溶解，因此，近年來展開了對該載體的改性研究。海洪等[17]用聚乙烯亞胺溶液處理海藻酸鈣凝膠，發(fā)現(xiàn)用聚乙烯亞胺-戊二醛交聯(lián)和聚乙烯亞胺-高碘酸鈉來強化凝膠顆粒，能提高其抗磷酸鹽的能力和機械強度，并且酶活力沒有變化，操作穩(wěn)定性較好。

海藻酸鹽作為一種無毒、低成本的固定化載體，隨著其改性研究的深入，應(yīng)用會更加廣泛。

2.3 聚丙烯酰胺和聚乙烯醇

聚丙烯酰胺(PAM)由丙烯酰胺單體聚合而成，是一種水溶性線型高分子物質(zhì)，具有良好的機械、化學(xué)和熱穩(wěn)定性能。Prabhune等[18]將具有青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶活性的大腸桿菌細胞固定于聚丙烯酰胺凝膠珠中，其水解活性顯著提高，且在使用90批次后，其酶活也沒有明顯損失。但是由于交聯(lián)過程中會放熱，細胞在固定化過程中酶活損失很大，因此對大腸桿菌表達的重組酶選擇性較高，使得其在大腸桿菌細胞的固定化中使用較少。

聚乙烯醇(PVA)是一種水溶性高分子聚合物,是目前國內(nèi)外研究較為廣泛的包埋固定化載體，其凝膠強度高、化學(xué)穩(wěn)定性好、抗微生物降解性能強、毒性很小、細胞的活性損失小，具有很大的開發(fā)利用價值。Huang等[19]用含硼硅酚醛樹脂PSB固定化E.coliATCC-11303細胞合成L-天冬氨酸，發(fā)現(xiàn)用聚乙烯亞胺處理的PSB固定化細胞后，細胞中L-天冬氨酸合成酶活性具有一定的特異性，而且底物的傳輸速率更快、凝膠強度更高，為L-天冬氨酸的大規(guī)模生產(chǎn)提供了更優(yōu)越的條件。

由于PVA凝膠顆粒具有非常強的附聚傾向，不易制備成珠體，限制了其工業(yè)化應(yīng)用。為了增強其傳質(zhì)和成球能力，需要在材料混合改性方面進行更深入的研究。

2.4 無機載體

多孔陶瓷、氧化鋁、活性炭、微孔玻璃、高嶺土、硅藻土等無機載體，大多具有多孔結(jié)構(gòu)，可以利用其吸附作用和電荷效應(yīng)將微生物或細胞固定。無機載體具有機械強度大、對細胞無毒性、不易被微生物降解、耐酸堿、成本低、壽命長等特性，是一類重要的吸附法固定化大腸桿菌細胞載體材料。

陳文謀等[20]用多孔陶瓷和浮石固定化重組大腸桿菌細胞合成β-葡聚糖，發(fā)酵液的酶活力分別達到97 U·mL-1和73 U·mL-1，比無載體液體發(fā)酵 (32 U·mL-1) 分別提高了3倍和2.3倍，并且固定化細胞具有良好的重復(fù)使用能力，在連續(xù)10批次實驗后，多孔陶瓷和浮石固定化發(fā)酵液的酶活力分別不低于91 U·mL-1和71 U·mL-1。

由于菌株與無機材料之間的結(jié)合力弱，易脫落，用無機載體固定化的細胞不適宜在流化床中長時間參與催化反應(yīng)，但可以利用無機載體孔隙大、傳質(zhì)容易等優(yōu)點，將其與其它傳質(zhì)效果差的材料混合使用，以提高產(chǎn)率。

3 固定化大腸桿菌細胞的應(yīng)用

近年來，隨著固定化細胞技術(shù)的日趨成熟，一些固定化大腸桿菌細胞的研究成果已經(jīng)應(yīng)用于制藥工業(yè)、環(huán)境保護、能源開發(fā)等領(lǐng)域。

3.1 小分子藥物生產(chǎn)

很多小分子藥物是利用重組大腸桿菌表達系統(tǒng)進行生產(chǎn)的，如果采用游離細胞發(fā)酵生產(chǎn)，存在產(chǎn)物分離純化困難、不易操作、生產(chǎn)成本較高等缺點。如果將重組大腸桿菌進行固定化培養(yǎng)，可以簡化目的產(chǎn)物的分離純化步驟，生產(chǎn)成本大幅降低。

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)廣泛存在于動植物和微生物中，是生物體內(nèi)最重要的非蛋白巰基化合物之一，廣泛用于治療肝臟疾病、腫瘤、氧中毒、衰老和內(nèi)分泌疾病。沈立新等[21]構(gòu)建了重組E.coliBL21 (pTrc-gsh) 菌，利用卡拉膠固定化后催化合成谷胱甘肽，采用延緩甘氨酸加入的方法，控制GSH的合成分階段進行，有效削弱了GSH的反饋抑制作用，GSH 的產(chǎn)率提高17.5%；在填充床中對催化合成GSH進行了考察，GSH合成量達1.24 g·L-1，比直接加入ATP提高24.2%。

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)是一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有效的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、保持神經(jīng)安定、改善腦機能、保肝護腎等作用。早在1883年γ-氨基丁酸就被人工合成。趙景聯(lián)[7]用海藻酸鈉固定化大腸桿菌細胞得到γ-氨基丁酸，并在間歇反應(yīng)、連續(xù)攪拌式反應(yīng)及連續(xù)柱式反應(yīng)等擴大生產(chǎn)中獲得了轉(zhuǎn)化率達85%以上的γ-氨基丁酸。隨后，沈俞等[22]又用卡拉膠與明膠復(fù)合載體固定化E.coli-AS1-505，結(jié)果表明,在卡拉膠與明膠質(zhì)量比為1.5∶1時， 12 g·L-1的混合膠在60 g·L-1的 KCl溶液中固定化80 g·L-1的菌體，3 h后，酶活回收率最高；包埋量為100 g·L-1的固定化細胞重復(fù)反應(yīng)7批次，可將40 g·L-1的底物完全轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸。

牛衛(wèi)寧等[16]對固定化E.coliJM109(pBR322-MAT)催化合成S-腺苷蛋氨酸的大腸桿菌細胞固定化方法和材料、反應(yīng)條件等進行了比較深入的研究。結(jié)果表明，采用2%海藻酸鈣固定化細胞連續(xù)反應(yīng)5批次后，固定化細胞酶活力為初始酶活力的91%；固定化細胞在35℃反應(yīng)8 h，底物轉(zhuǎn)化率超過95%。

3.2 廢水處理

大腸桿菌細胞固定化技術(shù)以其微生物密度高、耐毒害能力強、微生物流失少、處理設(shè)備小型化等優(yōu)點在廢水處理領(lǐng)域中引起了普遍關(guān)注。

謝珊等[23]利用固定化基因工程菌E.coliBL21/pET2opd2b1處理有機磷混合農(nóng)藥廢水，結(jié)果表明，固定化大腸桿菌細胞的降解速率與懸浮工程菌細胞相比有所降低，主要是受底物傳質(zhì)過程的限制和固定化過程對細胞活性的損害的影響，但固定化細胞比懸浮細胞有更高的比降解速率，工程菌細胞的穩(wěn)定性較好(在50 d內(nèi)活性保持良好)，而且與懸浮細胞相比，工程菌細胞不易流失，單位反應(yīng)體積內(nèi)的細胞密度增加了，工程菌細胞的耐毒害能力也大大增強，因此更適宜于實際廢水處理和大規(guī)模應(yīng)用。

萬瓊等[24]用固定化重組大腸桿菌細胞處理尿素廠廢水，中試研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)21 h后，廢水中總氮、氨氮和尿素的去除率可達90%以上，該法工藝簡單經(jīng)濟，基本不產(chǎn)生污泥，對高濃度氨氮和有機氮有較強的抗抑制作用。

3.3 能源開發(fā)和化工原料的生產(chǎn)

由于化石燃料的燃燒已對全球環(huán)境造成嚴重污染，甚至對人類生存造成威脅。氫能作為理想的清潔能源之一，引起了人們的廣泛重視。目前，氫氣的工業(yè)化生產(chǎn)大都采用物化法，需要消耗大量的電能和礦物原料，生產(chǎn)成本過高，從而限制了氫能的發(fā)展。

Yokoi等[25]以葡萄糖為底物對產(chǎn)氣腸桿菌E.aerogenesHO-39菌株進行的非固定化實驗中，產(chǎn)氫速率僅為120 mL·L-1·h-1；采用多孔玻璃作為載體對菌體細胞進行固定化后，產(chǎn)氫速率提高到850 mL·L-1·h-1，較非固定化細胞產(chǎn)氫速率提高了7倍。

Chittibabu等[26]構(gòu)建了重組菌E.cloacaeIIT-BT-08，并對其進行固定化，產(chǎn)氫量較野生型菌株提高了3.12 mol·(mol葡萄糖)-1，最高產(chǎn)氫速率為66 mmol·h-1，而相同條件下游離菌催化產(chǎn)氫速率僅為0.55 mmol·h-1。

1,3-丙二醇(1,3-Propanediol,1,3-PD)是一種重要的溶劑和化工原料。為了得到高產(chǎn)量的1,3-PD，張曉梅等[9]構(gòu)建了工程菌JM109 (pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)，在最適培養(yǎng)條件下，1,3-PD的產(chǎn)量和生產(chǎn)能力分別達到43.1 g·L-1和1.54 g·L-1·h-1；將該菌細胞用海藻酸鈣固定化后，細胞對底物甘油和產(chǎn)物1,3-PD的耐受力有了明顯的提高，1,3-PD產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)能力分別可達61.5 g·L-1、76.8%和2.57 g·L-1·h-1。

4 結(jié)語

大腸桿菌表達系統(tǒng)已經(jīng)成為表達外源蛋白最常用的表達系統(tǒng)之一，而固定化大腸桿菌細胞因操作簡單、成本低廉等優(yōu)點在工業(yè)化生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用前景。

大腸桿菌細胞固定化技術(shù)還需要在以下方面進行更深入的研究：(1)利用磁性聚合物微球、超臨界技術(shù)、納米技術(shù)等改進大腸桿菌細胞固定化方法。(2)尋找價廉、半衰期長、底物易于擴散、對大腸桿菌細胞毒性小的固定化載體材料，進一步研究混合使用各種材料，令材料間優(yōu)勢互補。(3)對大腸桿菌催化反應(yīng)機理及動力學(xué)進行更深入的研究，完善高效的固定化反應(yīng)工藝，使其滿足大型化、自動化和連續(xù)化生產(chǎn)的需要，充分體現(xiàn)固定化細胞生物反應(yīng)器的優(yōu)勢。(4)在多種菌株共生的固定化體系以及生物再生技術(shù)方面也有待更深入研究。

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