膽總管結扎術誘導大鼠肝纖維化模型的建立

邵文武,張 輝

(佳木斯大學,黑龍江 佳木斯 154007)

目前我國肝硬化的發病率呈上升趨勢,已經嚴重危害人民身心健康。肝纖維化是許多肝臟疾病發展的中間環節[1],最后會發展為肝硬化。因而早期診斷,治療肝纖維化具有極其重要的臨床意義,屬于當今醫學界重點研究課題之一[2]。本文作者用 Wistar大鼠成功建立肝纖維化模型,為進一步研究肝纖維化的發病機制、早期診斷和治療方法等奠定堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性 Wistar大鼠90只,體重約200g,由佳木斯大學實驗動物中心提供。分為 5組 ,正常對照組10只,模型組 4組,各20只。

1.2 實驗方法

飼養7d,實驗采用無不良反應,飲水、飲食以及活動正常者。給予膽總管結扎 ,時間分別是 24h、 48h、 96h、168h。結扎后乙醚麻醉大鼠,處死動物后立即取肝臟。肝組織標本以中性福爾馬林溶液固定、石蠟包埋,進行常規 HE染色和直接免疫熒光法染色,分別用光學顯微鏡和熒光顯微鏡進行觀察。

2 結果

2.1 肝纖維化模型的成功率

80只大鼠制模成功68只,建模成功率高達 85.0%。其中,第24小時模型組死亡1例,建模成功率為95%,第 48小時模型組死亡 2例,建模成功率為90%,第96小時模型組死亡4例 ,建模成功率為 80%,第 168小時模型組死亡 5例 ,建模成功率為75%,模型組大鼠肝纖維化形成隨著時間的增加,愈發典型。

2.2 病理組織學觀察

正常組大鼠肝小葉結構清晰,呈正常肝組織結構。BDL24h后,門脈區域的膽小管內腔擴張明顯,在 48h后膽小管上皮細胞增多,同時門脈區域間質發現有腫脹變化。96h后可見到門脈區域擴大以及增殖的膽小管上皮細胞周圍的間質細胞有顯著增多。168h后可以觀察到在肝實質內有膽小管的大量增殖。大鼠 HE染色中可見肝組織病變區域多,面積大,假小葉形成。168h免疫熒光顯示在匯管區附近有膠原沉積。

3 討論

肝纖維化的病理改變是肝內沉積過度的細胞外基質,多數慢性肝病人都有不同程度的肝纖維化,其中大約有30%～40%會發展成為肝硬化甚至肝癌。因此,治療肝纖維化就成為治療慢性肝病中的一個關鍵問題[3]。建立比較好的肝纖維化動物模型,對開展肝纖維化基礎研究有極其重要的意義,可以為臨床對肝纖維化進行早期診斷、早期治療提供相應的理論和實驗依據,具有重要的臨床意義和價值。近幾年來,通過不同的實驗方法誘導不同類型的肝纖維化模型,已經取得了可喜的成就。主要有膽總管結扎法、四氯化碳、血清制品、重金屬、二甲基亞硝胺、硫代乙酰胺、酒精及復合因素的建立模型方法[4]。膽總管結扎術是誘導大鼠肝纖維化模型中較為廣泛應用的技術,該模型在肝纖維發生相關的組織學、生物化學、細胞和分子改變等方面具有最好的特性。本實驗采用膽總管結扎術模型復制方法,既可有效形成肝纖維化模型,同時建模時間又比較短,而且建模成功率高達85.0%。本實驗結果顯示膽總管結扎術96h和168h模型組大鼠肝功能明顯受損傷,膠原纖維面積密度明顯增加,匯管區大量纖維組織增生,較粗的纖維間隔伸入肝組織內,形成大小不等的假小葉。另外,在建模失敗死亡的大鼠尸檢中發現,組織學觀察見肝細胞大面積壞死伴有中性粒細胞浸潤,嚴重感染為模型組大鼠的死亡原因。因此,在實驗過程中保持嚴格的無菌操作以及防止感染是保證建模成功的重要因素。本實驗成功地建立了大鼠肝纖維化模型,為后續實驗做了鋪墊,也為深入研究診斷以及治療肝纖維化提供了理想的動物模型。

[1] Su GL,Klein RD,Aminlari A,et al.Kupffer cell activation by lipopolysaccharide in rats:role for lipopolysaccharide binding protein and toll-like receptor 4[J].Hepatology,2000,31(4):932-936

[2] 楊舜民,周玲玲,張良,等.紫七軟肝對四氯化碳所致慢性肝纖維化大鼠的肝保護作用 [J].南京中醫藥大學學報,2002,18(6):345-346

[3] 唐桂連.肝星狀細胞與肝纖維化 [J].實用醫技雜志,2007,14(1):116-117

[4] Tsukamoto H,Matsuoka M,French SW.Experimental models of hepatic fibrosis:a review.[J].Semin Liver Dis,1990,10(1):56-65