氯霉素的不良反應及其殘留檢測方法研究進展*

高 林

(通標標準技術服務(上海)有限公司,上海 200233)

氯霉素(chloramphenicol,CAP),分子式為C11H 12 C12 N2 O5,于 1947年從委內瑞拉鏈霉菌(Streptom yces venezuela)的培養濾液中分離出的結晶性抗菌素。氯霉素的脂溶性高,可通過彌散進入細菌細胞內,可逆地結合在細菌核糖體的50 S亞基上,阻斷轉肽酰酶的作用,干擾帶有氨基酸的胺基酰-tRNA終端與50 S亞基結合,使肽鏈增長受阻,抑制肽鏈的形成,從而阻止蛋白質的合成。氯霉素也可與70 S核糖體進行可逆性結合,抑制線粒體的蛋白合成,對人體產生毒性。因此氯霉素殘留問題已引起國際組織和世界上許多國家和地區的高度重視,歐盟、美國等均在法規中規定CAP殘留限量標準為“零允許量”[1]。

氯霉素殘留檢測方法的建立始于20世紀70年代,隨著新技術的不斷出現,氯霉素的檢測方法有很多種,可分別為微生物法、化學分析法、免疫學檢測法及其他分析方法。

1 氯霉素的不良反應

1.1 對血液系統的影響

氯霉素可引起骨髓造血機能紊亂。一是可逆性的引起各類血細胞減少,可引起血小板減少性紫癜、粒細胞缺乏癥,并且與藥物的劑量有關;二是不可逆地引起再生障礙性貧血,發生較晚但極為嚴重,死亡率高,與劑量療程無直接關系。氯霉素引起的嚴重骨髓損害者中少數幸存者可能逐漸發展至粒細胞性白血病。

1.2 灰嬰綜合癥

由于早產兒及新生兒的肝內酶系統發育尚不完全,葡萄糖醛酸結合的能力較差,使氯霉素的代謝、解毒過程受限制;應用大劑量氯霉素后血藥濃度異常增高引起嬰兒的循環衰竭(灰嬰綜合癥),偶爾也發生在低劑量治療時。此外,由于早產兒及新生兒的腎臟排泄能力亦較弱,容易引起藥物蓄積中毒。

1.3 對神經系統的影響

氯霉素可引起中毒性精神病,主要表現為幻視、幻聽、定向力喪失、精神失常等。偶可引起視神經炎、多發性神經炎、球后視神經炎及視力障礙,神經性耳聾以及嚴重失眠,并發展至視神經萎縮和失明。

1.4 變態反應

少數患者可出現皮疹、藥物熱及血管神經性水腫等過敏反應,直接接觸氯霉素可發生接觸性皮炎或接觸性結膜炎。

1.5 其他

口服氯霉素可以引起消化道癥狀和口部癥狀,如食欲減退、惡心、腹瀉以及口角炎、口腔苦味、口腔黏膜充血、疼痛、糜爛、舌炎等。

2 氯霉素殘留檢測方法

2.1 微生物法

微生物檢測氯霉素法可大體分為兩類,一類是基于抗生素對微生物的抑制作用,如樣品中含有殘留的抗生素,則對培養基中的細菌產生抑菌圈,根據抑菌圈的有無及大小來判定結果,采用不同的實驗菌,可檢測不同的抗生素殘留,主要有棉簽法、杯碟法、紙片法、TTC法、戴爾沃檢測、BY法等;另一類是由于微生物對氯霉素敏感而引起生化特性的變化,如氯霉素對發光桿菌的抑光作用,通過檢測發光強度的變化來檢測氯霉素的含量。

2.1.1 杯碟法 樣品經處理后,注入牛津杯中,與含菌液的鑒定平板貼合,培養后,根據抑菌圈有無及大小判定結果。采用不同的試驗菌種,可檢測不同的抗生素。研究表明,此法檢出限為0.25μg/g;氯霉素濃度在0.25μg/g～1.00μg/g時平均回收率為67.5%。該方法的靈敏度比棉簽法高,但要進一步提高靈敏度很困難。

2.1.2 棉簽法 棉簽法,又稱現場拭子法,是檢測動物體中抗生素殘留的現場試驗方法。該方法是用棉簽采集動物體內的組織液,然后將其放置于涂滿枯草桿菌的培養基中保溫過夜。根據棉簽周圍的抑菌圈有無以及大小來判斷抗生素殘留。

2.1.3 TTC法 在樣品中加入嗜熱鏈球菌經培育2.5 h～3 h后,加入 40 g/LTTC(三苯基四氮唑)指示劑水浴培養30 min,顏色不發生變化為陽性;如果樣品呈紅色則為陰性。該法費用低,操作簡單,缺點是易出現假陽性。

2.1.4 戴爾沃檢測法 原理是利用微生物-嗜熱芽胞菌在64℃條件下培養2.5 h～3 h后會產酸,酸引起指示劑BCP(溴甲酚紫)變為黃色;若樣品中不含抗生素,培養后樣品呈黃色,如樣品中含有抗生素,嗜熱芽胞菌生長受到抑制而無法產酸,指示劑將不變色。該法具有操作方便,容易判斷,結果可靠,費用適中等優點,但也易出現假陽性。

2.1.5 藍黃檢測法(BY法) BY法是一種廣譜的微生物抑制法,能在較短的時間里檢測到樣品中抗生素的殘留,通過顏色的對比判斷陽性、陰性和可疑樣品。此方法耗時短,操從簡單,檢測抗生素種類較多,但誤差較大,容易誤檢。

2.1.6 發光細菌法 Shakila R J等[2]報道了一種改進的微生物法檢測蝦組織中氯霉素的含量,該法是利用從墨魚中分離得到的一株魚發光菌(P.leiognathi L-2),在氯霉素存在的條件下,其生長受到抑制并產生抑制圈,根據抑制圈的直接大小判斷氯霉素的殘留量。該法的檢測限為1μg/kg,回收率高達95.63%。

王亞群等[3]建立了另一種發光細菌(P.leiognathi YL)檢測氯霉素殘留的新方法,該法利用氯霉素對鰒發光桿菌發光的抑制作用,通過光強的變化檢測氯霉素的含量。線性范圍為0.1 ng/mL～1.0 ng/mL,相關系數R為0.989,該法具有成本較低,操作快速簡單,檢測限低的優點,最低檢測限為0.1 ng/mL,可以作為水產品中痕量氯霉素殘留的一種快速、靈敏的檢測方法。

2.2 免疫分析法

免疫分析法是以抗原與抗體特異性、可逆性結合反應為基礎的一類常用分析方法。由于氯霉素是半抗原,不能刺激機體產生抗體,可將氯霉素的二氯酰胺醇和硝基苯結構和大分子蛋白結合后均可作為完全抗原有效制備相應的抗體,在此基礎上建立酶聯免疫競爭法測定氯霉素含量,常用的有酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、放射免疫法(RIA)、固體免疫傳感器、化學發光酶免疫法(CLEIA)等。

2.2.1 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) ELISA的原理是試樣中殘留的CAP與試劑盒中的CAP酶標記物共同競爭CAP抗體,形成有酶標記或無酶標記的抗原抗體復合物而被吸附于微孔板底,用酶標儀在450 nm處測定吸光度,根據吸光度值得出樣品中CAP的殘留量。此方法簡單、快速、靈敏度高、重復性較好,適用于大規模CAP的殘留篩選檢測。Wesongah JO等[4]用競爭性酶聯免疫法檢測紅馬賽羊血液中的氯霉素殘留,檢測限為0.1 ng/mL。

目前市場上有多種氯霉素檢測試劑盒供應。陳雪昌等[5]報道了采用德國R-Biopharm公司的 RIDASCREEN氯霉素試劑盒檢測蝦肉中的氯霉素殘留方法,該法平均檢測下限為0.0125μg/kg,回收率為88.1%～94.4%,RSD為2.98%～6.67%。美國IDS公司2009年3月新上市了一步法快速氯霉素ELISA試劑盒,是目前市面上操作時間最短的產品,反應在包被了氯霉素抗體的固相微孔板上進行,采用抗體直接包被微孔的一步法反應方式,檢測時間為20 min,檢測下限為0.1 ppb。但是ELISA的缺點在于影響因素較多,易出現大量假陽性結果。抗體批次不同,測定結果也會出現差異。

2.2.2 免疫膠體金法 免疫膠體金技術是20世紀80年代發展起來的一種新型免疫標記技術,應用該技術制成的膠體金試紙條具有簡便、快速、靈敏、特異性高等優點,但其穩定性及靈敏度尚待進一步提高,且不宜定量。李余動等[6]建立了膠體金免疫層析試紙條法快速檢測蝦肉等組織試樣的氯霉素殘留,靈敏度最低值可達到1 ng/mL,只需5 min～10 min。王瑋等[7]制備了平均粒徑20 nm的膠體金標記抗氯霉素多克隆抗體;將氯霉素半抗原與卵清蛋白的偶聯物包被在硝酸纖維素膜上作為檢測帶,羊抗兔二抗作為質控帶,依據免疫競爭法原理,建立通過免疫膠體金滲濾式試紙條檢測六種淡水魚及牛乳中氯霉素殘留的方法,樣品前處理方法簡便,方法靈敏度為1μg/L。

2.2.3 CHARM Ⅱ CHARM Ⅱ檢測氯霉素殘留試劑盒為美國 FDA推薦使用的檢測儀器,由美CHARM Science公司研制生產的第2代產品。此法的基本原理是將免疫抗體溶于水后,加入含氯霉素的樣品中,在一定的孵育溫度下,樣品中的氯霉素與受體位點結合,再加入H I標記的氯霉素抗原與多余的受體位點結合,孵育一段時間后離心沉淀,取沉淀物加閃爍液,用CHARM Ⅱ分析儀測定熒光強度,樣品中氯霉素殘留量與熒光強度成反比。對于魚組織中氯霉素殘留量的檢出限可達0.15μg/kg,但同樣存在假陽性結果的問題。

2.2.4 放射免疫法 A rnold D等[8]建立了放射免疫分析檢測方法,該方法靈敏度高,最低檢測限為200 ng/kg,但該法具有同位素半衰期短、存在放射性污染及需要復雜儀器設備等缺點,應用范圍受到限制。陳小雪等[9]建立CharmⅡ放射免疫系統測定水產品中氯霉素殘留的分析方法,用CharmⅡ檢測氯霉素殘留試劑盒中的MSU萃取緩沖液,對樣品中的氯霉素殘留進行提取,通過競爭性受體免疫反應,采用液體閃爍計數儀計數。cpm讀數的相對標準偏差為2.4%～8.8%。

2.2.5 化學發光酶免疫法 化學發光酶免疫分析(CLEIA)是一種采用化學發光劑做為酶反應底物的酶標記免疫測定的方法,常用的標記酶有兩種即辣根過氧化物酶(H RP)和堿性磷酸酶(AP)。胥傳來建立了化學發光酶免疫檢測方法(CLEIA)檢測對蝦組織中CAP的殘留,檢測靈敏度可達到0.01μg/L;檢測范圍為0.03μg/L～23.7μg/L。高彬文等[10]利用化學發光酶聯免疫法檢測魚蝦中氯霉素殘留,檢測限為5.8×10-4μg/kg。該法靈敏度高、線性范圍寬、分析速度快、儀器簡單、不需復雜的樣品前處理過程等優點,但ECLIA法對實驗條件的要求較高,其穩定性及敏感性尚待進一步提高。

2.2.6 伏安免疫法 Song W W等[11]建立了以間接競爭ELISA為基礎,A LP為標記酶,pNPP底物,伏安法為檢測法的伏安免疫分析體系,該方法檢測CAP的檢出限為 0.064μg/L,檢測線性范圍為0.15μg/L～600μg/L,與傳統的ELISA法相比,此法靈敏度高、特異性強,操作簡單,但汞易揮發且有毒,同時滴汞電極上的殘余電流較大,限制了測定的靈敏度,分辨率低。

2.2.7 免疫芯片法 Gao Z X等[12]報道了同時檢測氯霉素、罌粟堿等5種化學物質的免疫芯片法。該法以牛血清蛋白做封閉劑,經過活性酯反應、戊二醛反應、氯甲酸異酯反應、混合酸酐反應、亞胺反應和重氮化反應,將CAP合成為CAP-BSA蛋白結合物,經過Sephadex G-25純化后,用Cy3熒光染料標記(CAP-BSA-Cy3),固定在醛基化玻片上的特異性抗體為探針,通過特異性抗原抗體反應計算氯霉素的含量,在CAP水平為0.001μg/mL～5μg/mL范圍內,R2＞0.99,RSD＜10%。免疫芯片法的優點是靈敏度高,速度快。

2.3 色譜技術

色譜方法可檢出樣品中的痕量污染物,具有檢測限低、精確度高等特點,是水產品中CAP殘留檢測的最有效的一類方法,但缺點是操作復雜、時間長、成本較高。在氯霉素殘留檢測方法上正在由各種分析技術聯用代替單一的色譜技術,目前檢測氯霉素常用的色譜法包括液相色譜法(LC)、氣相色譜法(GC)、氣相質譜聯用法(GC-MS)、液相質譜聯用法(LC-MS)、氣相色譜電子捕獲檢測器(GC-ECD)等。

2.3.1 LC法 高效液相色譜法檢測氯霉素是一種靈敏度較高、可靠性較強的一種方法,此法不需衍生化步驟、樣品處理程序較為簡單、重復性好、假陽性少,但檢出限較高,為5μg/kg～10μg/kg,回收率偏低,處理過程復雜、分析速度慢等缺點。

黃志勇等[13]建立了采用高效液相色譜(HPLC)檢測養殖水產品中氯霉素殘留的方法,樣品經乙酸乙酯提取2次后,再通過凈化和濃縮處理,以甲醇∶水(35∶65)為流動相進行HPLC分離氯霉素組分并于278 nm下測定其色譜峰信號,在50μg/mL～1 000μg/mL范圍內,線性關系 R2=0.999 4,檢出限為14μg/kg。平均加標回收率為93.2%,RSD小于5%。

Chen H X等[14]報道了用液相色譜可變波長檢測器(LC-VWD)檢測蜂蜜中的氯霉素的殘留,該法通過將30μL四氯乙烷萃取液和1 mL乙腈分散劑混合液注入到5 mL的蜂蜜中進行萃取,氯霉素位于四氯乙烷層,離心沉淀后,用液相色譜可變波長檢測器進行檢測,在30μg/kg～2 000μg/kg范圍內成線性關系,濃縮因子為68.2,S/N=3時,最低檢測限為0.6μg/kg,RSD為4.3%,該法擁有回收率高、重復性好、快速、高濃縮因子等優點。

2.3.2 GC法 利用氣相色譜法檢測氯霉素的優點是高分離效能、檢出限低、靈敏度高,但需要衍生化,過程繁瑣,易出現假陽性。白艷玲等[15]報道了用ECD-氣相色譜儀測定水產品中氯霉素殘留。該方法用乙酸乙酯提取水產品組織中的氯霉素,濃縮后用含NaC1的正己烷抽提脫脂,樣液經C18固相萃取小柱凈化,BSTFA+TMCS衍生化,最后進樣檢測。回收率在 86.3%～95.3%,最低檢出濃度達到0.02 ng(S/N=3),線性范圍為 2.5 ng/mL～5 000.0 ng/mL,相關系數r=0.999 5,相對標準偏差為5.02%～9.04%。該方法具有靈敏度高,樣品提取簡單等特點。Cerkvenik-Fajs V等[16]報道了采用氣相色譜電子捕獲器(GC-ECD)檢測動物肌肉組織中氯霉素的殘留,用氯霉素的異構體作為內標,r=0.999 1,最低檢測限為0.07μg/kg,該法重復性好,假陽性少。

2.3.3 聯用技術 聯用技術可揚長避短,一般兼分離、定量和定性于一體。常見的聯用技術有LCMS、LC-ESI-MS/MS、CEIA-LIF、GC-NCI/MS、SFC-MS 、CZE-MS 、LC-NMR 等 。

LC-MS是美國FDA推薦使用的氯霉素確證方法,其靈敏度較熒光檢測器高1個數量級,能方便地對ng/kg級的殘留組分進行檢測與結構確證。

林海丹等[17]報道了水產品中氯霉素藥物殘留的LC-MS/MS分析方法,該法測定檢出限0.1μg/kg,回收率為 95%～110%。Zhang S X等[18]采用LC-MS檢測雞肉組織的中殘留的氯霉素,樣品通過乙酸乙酯抽提、己烷脫脂、Oasis MCX固相小柱凈化,然后以流速為0.20 mL/min的乙腈水進行梯度洗脫分離,然后在多反應檢測下進行電噴霧質譜檢測。該法檢測CAP的最低檢測限為0.1μg/kg,線性范圍為 0.3μg/k～ 20μg/kg,回收率為95.1%～107.3%,RSD＜10.6%。

Zhang C等[19]報道了利用毛細管電泳激光誘導熒光免疫法(CEIA-LIF)檢測動物源食品中的氯霉素的殘留量,當添加水平為0.008m g/L～5 mg/L時成線性關系,最低檢測濃度(LOD)高達0.001 6mg/L,該法快速、簡便、靈敏,是普通ELISA的20倍。

Shen JZ等[20]用氣相色譜-負化學離子源-質譜(GC-NCI/MS)聯用技術檢測家禽的肌肉以及肝臟組織中的CAP的殘留。樣品組織通過乙酸乙酯抽提、己烷液液萃取、Oasis H LB固相小柱凈化,再用BSTFA+1%TMCS分離目標物,在負化學源(NCI)選擇離子檢測(SIM)操作模式下,進行GC-NCI/MS檢測。該法的回收率為78.5%～105.5%,RSD＜17%,CAP的最低檢測濃度為0.1μg/kg。

2.4 其他方法

2.4.1 高通量懸浮點陣技術(suspension array technology) 懸浮點陣技術是一項液相基因型分析方法和熒光標記的微珠捕獲過程相結合的新技術,Liu N等[21]報道了同時檢測CAP、克倫特羅和17-β-雌二醇3種獸藥的高通量懸浮點陣技術。方法中用牛血清蛋白(BSA)對CAP進行CAP-BSA復合物螯合,帶熒光標記的微珠上的羧基與BSA上的氨基進行連接從而將 CAP固定在微球上,特異性的mAbs抗體對CAP-BSA復合物進行捕獲,通過添加不同濃度 mAbs產生熒光強度變化,從而計算出CAP的含量。CAP的檢測范圍為 0.04μg/L～625μg/L,R2＞0.989;該法具有高通量,多功能性,靈活性,準確性和重復性。

2.4.2 表面電漿共振法(surface plasmon resonance,SPR) 表面電漿共振是一可用于測量介面附近光學特性變化且具有高靈敏度的檢測方法,有極高的靈敏度,無須標定(label-free)的優點更勝于一般的螢光檢測技術、色相層析法。Dong Z等[22]報道了一種基于SPR系統的用于小分子無標實時檢測食品中氯霉素殘留的分子檢測技術,主要原理是特異性分子間的相互作用和間接競爭免疫反應,該法靈敏度高,最低檢測限為0.5 ng/mL。

2.4.3 分子印跡基質固相分散(M I-MSPD) 基質固相分散(MSPD是近幾年發展起來的一種新的樣品前處理技術,對固體、半固體或黏性液體樣品中目標物質分析具有獨特的特性,在現代農藥殘留分析中應用越來越廣泛;同時分子印跡聚合物(M IP)的預見性、識別性和實用性三大特點以及其廉價的成本應用于復雜基體的微量痕量分析有著十分廣闊的前景。陳翠玲[23]報道了采用分子印跡技術結合GC檢測蝦肉組織中氯霉素殘留,該法以氯霉素作為模板分子,丙烯酞胺為功能單體,乙二醇二乙酸酯為交聯劑,偶氮二乙丁氰作引發劑,采用熱聚合和光聚合的方法聚合。當氯霉素的濃度為0.005μg/mL～0.1μg/mL,r=0.987,回收率為92.0%～120%,檢測限為0.5μg/kg。

Guo L Y等[24]也報道了利用分子印跡技術合成對氯霉素有特異吸附作用的分子印跡聚合物作為固相萃取柱的固定相結合HPLC法檢測魚組織中氯霉素殘留的方法,該法的最低檢測限為1.2 g/kg。

2.4.4 溶膠免疫色譜法 Stidl R等[25]報道了利用溶膠凝膠柱上的特異性抗CAP抗體吸附樣品中的CAP來預處理蝦組織,然后采用HPLC檢測CAP的含量,回收率為68%,RSD＜4%,該法的優點是消除了基質干擾,特異性強,缺點是靈敏度低。

2.4.5 伏安電化學法 Agui L等[26]報道了用電化學活化碳纖維微電極檢測牛奶中氯霉素的含量的伏安法,線性范圍為0.032μg/mL～0.32μg/mL,r=0.999,最低檢測限為0.015μg/mL。Xiao F等[27]采用由單壁碳納米管、納米金顆粒和離子溶液構成的復合膜修飾玻碳電極的伏安法測定氯霉素含量,該法線性范圍為 0.032μg/mL～19.2μg/mL,最低檢測限為1.6μg/mL×10-3μg/mL。電化學法與其他方法比較有著快速、低成本、靈敏度高等優點。

3 結語

用于檢測氯霉素殘留還有很多其他分析方法,如超臨界流體色譜(SFC)、掃面示波、毛細管區域電泳(CZE)、氯霉素乙酰轉移酶突變體檢測等。總之,基于抗原抗體特異性反應建立起來的免疫學測定方法靈敏度較高,特異性強,試樣預處理簡單,分析時間短,現在已出現一些試劑盒產品,使用方便;色譜方法可檢出樣品中的痕量污染物,具有檢測限低、精確度高等特點,但是存在著操作復雜、時間長、成本較高的問題;同時一些新的生物學方法也不斷得以研究開發,如發光細菌檢測氯霉素、氯霉素乙酰轉移酶突變體檢測等由于具有操作簡便、靈敏度高等優點也逐漸得到運用。

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