PRRSV云南株的分離與鑒定*

段博芳,沈艷萍,楊貴樹,張 飛,吳靜敏,段 綱,尹革芬*

(1.云南農業大學動物科學技術學院,云南昆明 650201;2.振太畜牧獸醫站,云南鎮沅 666508)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine productive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸衰竭為主要癥狀的傳染病,臨床癥狀主要表現為母豬流產、早產、產死胎、產木乃伊胎、仔豬成活率下降和育成豬呼吸道癥狀等[1]。PPRS于1987年在美國北卡羅來納州首先發現[2],隨后在荷蘭、加拿大、德州、英國、西班牙、瑞士、法國等世界許多國家和地區均有發生[3]。1991年Wensvoort G等[4]用豬巨噬細胞(PAM)從發病豬群中分離到PRRSV(歐洲型)。1996年郭寶清等[5]用 PAM 和Marc-145細胞首次從國內發病豬群中分離出PRRSV,隨后我國的許多省都相繼用肺泡巨噬細胞(pulmonary alveolar macrophage,PAM)和Marc-145細胞分離到PRRSV毒株。自2007年以來,我國有26個省份先后發生了高致病性PRRS疫情,對我國的養豬業造成了極大的危害和重大的經濟損失,嚴重影響了農民的增收和豬肉消費市場的穩定以及養豬業的生產安全。2007年楊貴樹等對云南省某些豬場PRRS血清流行病調查表明 PRRS血清陽性率為90.8%[6]。表明PRRS已經在云南省存在,本試驗從云南某豬場送檢樣品(病死豬肺)中分離出一株疑是PRRSV,并對其進行初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 云南某豬場送檢樣品,經 RTPCR初步檢測為PRRSV陽性。

1.1.2 細胞及相關試劑 Marc-145細胞由云南農業大學動物科學技術學院動物醫學實驗室保存;原代PAM細胞為自行分離;MEM粉劑(GIBiCO);1640細胞培養液(GIBCO);標準胎牛血清,天津瀕洋生物公司產口;雙抗,美國GIBCO公司;胰酶粉,T ryPSIn:1:250,華美生物工程公司產品;血樣(液體樣本)RNA提取試劑盒,百泰克生物有限公司產品;反轉錄試劑盒,TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 病料的處理 按參考文獻[7]方法操作,采集發病豬的肺臟,勻漿器研磨后用無血清的MEM制成懸液,凍融3次,2 500 r/min離心15 min取上清,濾網過濾后,0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌。置-20℃冰箱保存,作為接種用。

1.2.2 細胞制備

1.2.2.1 Marc-145單層細胞的制備 Marc-145細胞自液氮罐中取出后,迅速置于37℃水浴中快速晃動,使細胞在2 min內很快融化,移入細胞培養皿中。加入含100 mL/L FBS和1/100雙抗的MEM營養液,置于37℃、體積分數為5%CO2培養箱中培養,12 h后換液。在隨后的培養過程中,觀察細胞生長情況,長成單層后進行傳代接種。

1.2.2.2 原代PAM的制備 豬臂動脈叢放血致死,剖開胸腔,結扎氣管后連同心臟取出完整的肺,去心臟及周圍脂肪等組織后,用無菌生理鹽水充分漂洗肺表面,除凈血塊污物。從氣管往肺部注入滅菌的PBS液40 mL,輕輕拍打肺表面,2 min后回收灌洗液。重復以上操作,直到共回收約200 mL。將回收的支氣管肺泡灌洗液用吸管輕輕吹打,使其細胞團以及黏液塊分散,用無菌的100目不銹鋼篩過濾,收集全部灌洗液,1 500 r/min離心10 min,棄上清。用無菌PBS重懸細胞沉淀,200目濾網過濾,1 500 r/min離心10 min,棄上清。得到細胞沉淀后按原代單層細胞培養法[8]進行培養,觀察細胞生長情況,長成單層后進行接毒。

1.2.3 病毒的分離 按照文獻[7]進行。將處理的病料接種于長成單層的M-145細胞和PAM細胞,每瓶1.5 mL;37℃吸附1 h后加入含有50 mL/L血清的培養液。每天觀察細胞病變(CPE)情況,當病變至70%～80%收毒,未出現CPE者,經反復凍融3次后取上清盲傳3代。

1.2.4 病毒的電鏡觀察 將分離毒經高速離心濃縮后送電鏡室進行電鏡觀察。

1.2.5 RT-PCR鑒定 按照引物設計原則,參照CH-1a株篩選設計一對引物(p1、p5),該對引物可擴增PRRSV的ORF7特異性片段,其長度為329 bp。p1、p5 的 序列 分 別為 :P1 5′-AATGGCCAGCCAGTCAATCA-3′;P5 5′-TCATGCTGAGGGTGATGCTG-3′

1.2.5.1 培養物中RNA的提取 提取方法按血樣(液體樣本)RNA提取試劑盒說明書操作。

1.2.5.2 反轉錄 按反轉錄試劑盒說明書進行。RT過程中體系的配制需在冰盒上進行;戴手套防止RNA酶污染。

1.2.5.3 PCR反應體系和條件 PCR反應在25 μ L反應體系中進行,依次加入以下成分:ddH2O 18 μ L,10 ×PCR buffer 2.5 μ L,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)1 μ L,正 反 方 向 引 物 各 0.5 μ L(10 pmol/μ L),0.5 U Taq 酶,模板 2 μ L,混勻短暫離心后置PCR儀中進行反應。反應程序為:94℃預變性3 min;94℃30 s,58℃30 s,72℃30 s,30個循環;72℃延伸 5 min;4℃保存。用10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳(120 V,30 min),觀察擴增結果。

1.2.6 動物回歸試驗 參照文獻[7]方法進行,將出現CPE的細胞培養物反復凍融3次后離心取上清,于P2級動物房里,將上清液接種到經RT-PCR檢測PRRSV陰性,血清學檢測PRV、CSFV抗體陽性的斷奶仔豬。每日觀察臨床癥狀,并記錄體溫。定期采血測抗體效價和RT-PCR檢測病毒。

1.2.7 間接免疫熒光試驗鑒定 試驗步驟按參考文獻[7]進行,被檢標本上滴加一抗為PRRSV陽性抗體,二抗為FIFC標記的羊抗兔IgG。自然干燥后滴加500 mL/L甘油,待干燥后。置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.8 病毒毒價測定(TCID50)參照文獻[7]方法進行,取已長滿的細胞,經消化后計數至1.5×105個/mL,于 96孔培養板中,每孔加入細胞懸液100 μ L,置 37 ℃、體積分數為 5%的 CO2培養箱中靜置培養。病毒液做從10-1～10-10梯度稀釋,接種到已長成單層的96孔板中,每一稀釋度設8個重復,每孔接種50 μ L,設 16個孔為正常對照。置37℃、體積分數為5%CO2培養箱中培養。每天早晚各觀察1次,觀察有無細胞病變,逐日觀察并記錄結果,一般需要觀察5 d～7 d。結果按 Reed-Muench兩氏法計算。

1.2.9 理化測定 理化特性檢驗分離病毒株,TCID50滴定方法測定對氯仿、紫外線、pH、熱的敏感性。試驗方法按參考文獻[7]進行。

2 結果

2.1 病毒的致細胞病變效應觀察

本試驗采用Marc-145和PAM兩種細胞對病料進行分離培養。病料在Marc-145細胞經盲傳2代～3代后,培養48 h～72 h后可見CPE(圖1)。連續傳6代后,CPE出現時間穩定,表現為細胞變圓,折光性降低,灶狀脫落,呈現大面積空洞。在PAM細胞上接毒后72 h細胞開始出現CPE,表現為細胞堆積,折光性降低(圖2)。

圖1 病毒在Marc-145細胞上的增殖Fig.1 Virus proliferation in M arc-145 cells

圖2 病毒在PAM細胞上的增殖Fig.2 Virus proliferation in the PAM cells

2.2 病毒的電鏡觀察

1∶40 000電鏡下可觀察到大小為45 nm～55 nm左右的病毒粒子(圖3)。

2.3 RT-PCR檢測

在細胞出現明顯CPE后,提取細胞RNA進行RT-PCR檢測PRRSV,所得結果為陽性(圖4)。

圖3 電鏡下病毒粒子Fig.3 Virions under electron microscope

2.4 動物接種試驗

將出現CPE的細胞培養物反復凍融3次后離心取上清,接種到1月齡PRRSV陰性的仔豬。在接種后1周沒出現異常癥狀,采血測抗體效價1∶40,RT-PCR未檢測到病毒。接種2周后仔豬出現體溫升高,呼吸急促,并伴有食欲廢絕,精神不振等癥狀,測抗體效價1∶20,RT-PCR能在豬血液中檢測到PRRSV(圖 5)。

圖4 細胞培養物RT-PCR擴增結果Fig.4 RT-PCR results of cell culture product

圖5 接種豬血液樣品RT-PCR擴增結果Fig.5 RT-PCR results of infected porcine blood sample

2.5 間接免疫熒光鑒定

熒光顯微鏡下觀察玻片,在接種Marc-145細胞的胞漿內出現黃綠色熒光:未接種的Marc-145細胞沒有見到熒光(圖6)。

圖6 間接免疫熒光試驗鑒定病毒Fig.6 Detection of P RRSV in infected Marc-145 cells by IFA

2.6 病毒毒價測定(TCID50)經測定

該分離株病毒的 TCID50為10-4.75/0.1 mL培養物。

2.7 主要理化特性測定

分離的毒株經終濃度48 mL/L氯仿4℃震蕩10 min處理后失活;經紫外照射(室溫30 min)處理后被滅活;經37℃水浴48 h或56℃水浴45 min后病毒完全失活;病毒經pH 5.0以下或pH 7.5以上在4℃的液體中作用2 h,病毒失活。結果表明,該分離到的病毒對氯仿、紫外線、熱、酸堿敏感。

3 討論

本試驗將CPE明顯的細胞培養物經高速離心濃縮后經電鏡觀察鑒定病毒粒子形態,電鏡下看到了直徑約為45 nm～55nm的圓形顆粒,這與國內相關報道相似[9]。研究表明[10-11],不同的 PRRSV毒株對細胞的嗜性也不同。無論體內或體外培養,PRRSV均可在單核巨噬細胞系統(包括肺泡巨噬細胞PAM、外周單核細胞、肺血管內巨噬細胞等)中復制,但更偏愛在PAM細胞上復制,其產毒量和毒價都較高。在體內,所有毒株對PAM的親嗜性最高;在體外,歐洲分離株(LV)僅能適應于豬肺巨噬細胞(PAM),并有致細胞病變效應(CPE),美洲分離株除了能在PAM細胞上很好的增殖并產生CPE外,還可在 CL2621、Marc-145、MA-104細胞系培養,并能出現CPE。本試驗所分離的 YN-1病毒株除能在PAM細胞上很好增殖并產生CPE外,還能在Marc-145細胞上增殖且產生CPE。表明所分離毒株為美洲株。

雖然尚未發現PRRSV有不同的血清型,但來源于不同地理位置的毒株之間的變異程度很大且流行過程中容易發生變異,因此不同毒株之間也存在著毒力以及抗原性的差異[7,11]。吳家強等[12]研究表明,當培養液pH在7.0～7.2范圍時,細胞密度在10×l04～15×l04個/mL范圍內,用含 80 mL/L血清的維持液,獲得的病毒高滴度是107.32～107.36TCID50/mL;而在相同條件下,嚴亞賢等[13]報道,上海分離株SH1株病毒,毒價為1×105.9TCID50/mL。而本研究試驗得出,細胞培養液pH在7.0～7.4范圍內,細胞密度在4×104～5×104個/mL范圍內,用含20 mL/L血清的維持液培養,病毒在Marc-145細胞上增殖產生CPE最明顯,TCID50較穩定,其毒價為10-4.75/0.1 mL,所分離獲得的云南PRRSV分離株為中等毒力毒株。從毒價來看,分離株與國內不同地區分離株之間存在差異。成功分離獲得的PRRSV YN-1株將為進一步開展云南省PRRSV感染機制及病原生物學相關研究奠定基礎。

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