RNA干擾在動物病毒病治療上的應用*

杜 斌,漢麗梅,張雷雷,李天來

(沈陽農業大學,遼寧沈陽 110161)

RNA干擾(RNA interference,RNAi)廣泛的定義為RNA引起的同源依賴性基因沉默現象(hom ology-dependent gene silencing,HDGS),狹義的定義為外源雙鏈RNA(double-strained RNA,dsRNA)介導的轉錄后基因沉默(post-transcrip tional gene silencing,PTGS)。它是人類近年來認識的一種廣泛存在于多種生物體內的抵御外來入侵的一種保護機制[1]。

目前,發現RNAi與真核生物的發育、癌癥的發生、基因表達的調控和抵抗病毒感染密切相關,具有重要的生物學意義,并顯示了良好的應用前景。近年來,隨著RNAi技術的發展,其在畜牧獸醫領域也得到了廣泛的應用,尤其是針對一些嚴重威脅畜禽生產、危害人類健康的疾病及特定基因功能的研究中取得了一定的研究進展,文章就RNAi的作用機制及其在畜牧獸醫領域的應用和展望做以綜述。

1 RNA干擾的作用機制

RNAi的作用分子主要有siRNA s、核糖核酸酶Dicer、RNA誘導沉默復合體(RNA induced silencing comp lex,RISC)[2]。當dsRNA導入細胞后,被一種dsRNA特異的RNAseⅢ型酶Dicer識別,切割成21 nt～23 nt的小干擾 RNA(sm all interfering RNA,siRNA),這些片段可與該核酸酶的dsRNA結合結構域結合,形成復合物即RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced,silencing comp lex,RISC)并被激活。在ATP參與下,激活的RISC將siRNA的雙鏈分開,RISC中的一個核心組分核酸內切酶(A rgonaute)Ago負責催化siRNA其中一條鏈去尋找互補的mRNA鏈,然后對目的m RNA進行切割,從而使目的基因沉默,產生RNAi現象[3]。在某些低等生物中沉默效應可以被放大,其過程是在 RNA依賴性的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polym erase,RdRP)作用下,以靶m RNA為模板,以反義鏈為引物,合成新的dsRNA。新的dsRNA又可以再次被切割成新的siRNA分子,這樣就可達到放大干涉效應的目的。

2 RNA干擾的抗病毒機制

RNA i分子機制在動物細胞中的高穩定性,使其成為了病毒學家們最給予厚望的全新的抗病毒策略,主要原因是,RNA i效應具有高效表達、快速和高度特異性的特征,有望彌補傳統的抗病毒疫苗或抑制劑的缺陷,因此,RNA干擾技術在畜牧獸醫領域中廣泛應用于抗病毒病的研究。其主要抗病毒機制為,病毒在動物細胞內的復制會產生dsRNA復制中間體,作為激活RNAi的作用因子,這些中間體經加工后形成沉默復合體,特異性的與目的病毒RNA或m RNA結合,并將其降解[4]。此外,科研人員模仿生物體內siRNA產生機制設計并合成了siRNA,再由病毒感染、轉座子侵入、或質粒轉染表達[2]來干擾病毒感染,以達到對病毒病治療的目的。試驗結果表明這些siRNA s介導的RNAi可以抑制病毒的復制、減少病毒RNA的數量和阻斷病毒蛋白的表達,在病毒病的治療上顯示出一定效果。

3 RNAi在常見畜禽疾病中的應用

3.1 RNA i在豬主要病毒感染中的應用

3.1.1 豬繁殖與呼吸綜合征 俗稱豬藍耳病,是由豬繁殖豬與呼吸綜合征病毒(Porcin rep roduce and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以母豬流產和仔豬呼吸困難為主要特征的傳染病。雖然疫苗在控制本病中發揮了重要作用,但由于PRRSV遺傳變異較快,疫苗對異源毒株攻擊的保護作用有限,因此,新型的基因工程苗正在研制開發之中,其免疫效果還需進一步研究。PRRSV基因組為單股、正鏈、不分節段RNA,含9個互相重疊的開放閱讀框,賀云霞等[5]針對其中的 3個閱讀框 ORF2、ORF3、ORF4,設計出相應的小干擾RNA,并構建對應的表達載體,然后轉染至M arc-145細胞系中,接入PRRSV后逐日觀察病變。結果顯示設計的小干擾RNA均可有效抑制目的基因的表達,但根據不同靶位點選擇的干擾序列對干擾效果有很大影響,且抑制作用在一定范圍內存在劑量依賴性。高曉飛等[6]篩選到針對編碼PRRSV核衣殼蛋白的N基因的2處靶序列作為候選片段,在M arc-145細胞上進行基因干擾試驗研究。結果由載體表達的SiRNA在Marc-145細胞中對PRRSV的增殖具有抑制現象。同時選取不同時間段對病毒進行TCID50檢測,以及對CPE出現時間進行觀察和免疫熒光檢測,得到RNA干擾對PRRSV增殖抑制作用的動態數據,結果干擾作用可持續到轉染后120 h。上述試驗表明,RNAi不僅能預防 PRRSV的增殖,而且在PRRSV感染細胞后轉染RNA干擾載體,仍能繼續抑制病毒增殖,表明干擾對病毒感染也有治療作用。

3.1.2 豬傳染性胃腸炎 豬傳染性胃腸炎(T ransmissible gastroenteritisof pigs,TGE)是由傳染性胃腸炎病毒(TEGV)引起的一種高度接觸傳染的病毒性疾病。TGE對首次感染的豬群造成的危害尤為明顯,在短期內能引起各種年齡的豬發病。日齡越小,病情愈重,死亡率也愈高。2周齡內的仔豬死亡率高達100%。目前對該病的防治以疫苗為主,由于TGEV的免疫屬于典型的局部免疫(黏膜免疫),而非全身性的體液免疫,滅活疫苗免疫應答產生較慢,且不能激發產生以IgA抗體為主的黏膜免疫反應;致弱的TGEV很不穩定,或出現返強,故弱毒疫苗的安全性有待提高[7]。因此,通過接種疫苗手段不能徹底控制本病的發生。

TGEV基因組為不分段的單股正鏈RNA,全長約28.5 kb,其中5′端近20 kb為基因l,編碼病毒的聚合酶(RNA依賴的RNA聚合酶,RdRp),此區具有明顯的保守性。它在該病毒的轉錄和復制等關鍵環節中起著重要的作用。已有報道選用其聚合酶基因為靶位點,研究對TGEV復制的抑制作用。于曉龍等[8]構建了表達互補 TGEV部分聚合酶基因的反義 RNA序列的逆轉錄病毒載體,并將其轉染IBRS-2細胞,以TGEV感染細胞和具有抗性的細胞所產生的細胞病變為指標,結果發現反義 RNA對病毒有明顯抑制作用,抑制率為80%,且抗性細胞系可明顯延遲因病毒感染引起的細胞死亡的時間。周俊芳等[9]設計篩選出2個靶向TGEV聚合酶基因的干擾片段,分別轉染豬睪丸(ST)細胞。通過細胞增殖試驗(M TS)和定量RT-PCR檢測試驗表明,這兩個質粒均可高效特異地抑制豬傳染性胃腸炎病毒的復制。研究結果表明,RNA干擾可以用來有效防制豬傳染性胃腸炎。

3.1.3 豬瘟 豬瘟是由豬瘟病毒(Classical sw ine fever virus,CSFV)引起的一種高度傳染性和致死性傳染病。不同品種和年齡的豬對此病毒都易感,每年因此給養豬業造成了嚴重的經濟損失。疫苗免疫接種是控制豬瘟的重要手段,但目前使用的弱毒疫苗株存在局限性及危險,它可能與野毒重組或突變致毒力返強,還可通過母豬胎盤感染造成胎豬死亡或仔豬具有免疫耐受性,因此期待一種更有效的控制方法。

CSFV基因組全長約12.3 kb,含有一個大的開放閱讀框(ORF),此ORF編碼一條由結構蛋白和非結構蛋白組成的3 898 aa的多聚蛋白。其中,NS3非結構蛋白基因在病毒的生命活動中起著重要的作用。冶貴生等[10]設計并合成了針對NS3不同位置的shRNA干擾載體,轉染PK-15細胞,并進行G418抗性篩選。克隆細胞擴大培養后,接種豬瘟病毒Shimen株,收集細胞分別進行實時定量PCR和ELISA光吸收度分析。RT-PCR結果顯示,設計的小干擾RNA均在一定程度上沉默了病毒基因,ELISA檢測結果也表明,重組載體轉染PK-15細胞后均在不同程度上抑制了豬瘟病毒粒子的增殖。王鐵東等[11]構建了針對豬瘟病毒Npro基因和NS4A基因m RNA的siRNA雙表達載體,轉染豬胚胎成纖維細胞后,在潮霉素B的篩選壓力下,獲得5株穩定整合shRNA表達盒的豬胚胎成纖維細胞克隆。以100 TCID50的CSFV分別感染96孔板內的上述細胞克隆,72 h后對感染細胞克隆進行間接免疫熒光分析及子代病毒滴度檢測,結果顯示,在所獲得的5株細胞克隆中,有3株細胞上豬瘟病毒的增殖明顯降低,表明所構建 siRNA雙表達載體轉錄產生的siRNA可以有效抑制CSFV的復制。上述結果均表明RNAi對CSFV有抑制作用,為CSFV的防治以及基因功能的研究提供了新思路、新方法。

3.2 RNAi在禽主要病毒感染中的應用

3.2.1 雞傳染性支氣管炎 雞傳染性支氣管炎是由雞傳染性支氣管炎病毒(Infections bronchitis virus,IBV)引起的雞的急性呼吸道、腎臟、生殖道等病變。作為養禽業常見病之一,IBV因血清型眾多,并且不同血清型之間的交叉保護很小,給IBV的預防和控制帶來了很難度。陳學輝等[12]用經SPF雞胚增殖的IBV感染Vem-E6細胞,經連續盲傳后,使病毒能夠在細胞中穩定復制。然后,針對IBV-T株RdRP和M蛋白基因,設計合成siRNA轉染至感染IBV的Vero-E6細胞中,觀察抑制效果。結果顯示,針對IBV-T株M蛋白基因的第154～174位點合成的siRNA,在對感染IBV-T株的Vero-E6細胞作用48 h后,能夠有效地阻斷M 蛋白基因的表達,同時抑制了病毒的增殖,抵抗了病毒對細胞的損傷。說明在細胞水平上,利用特異的siRNA能夠有效的抑制IBV的增殖。劉惠莉等[13]篩選到針對傳染性支氣管炎病毒Po l、M 和N基因的12個siRNA作為候選目的基因片段,分別在Vero細胞、9日齡SPF雞胚上進行基因干擾試驗。結果表明,來自Pol、N靶序列的2個siRNA在Vero細胞上及雞胚上均對IBV增殖產生明顯的干擾作用,轉染的雞胚未見肉眼可見病變,而對照雞胚眼觀病變明顯,并有明顯出血,表明siRNA對IBV感染有治療作用。

3.2.2 雞馬立克病 雞馬立克病(Marek＇s disease,MD)是由雞馬立克病病毒(MDV)引起的雞的一種高度傳染性淋巴組織增生性疾病。病雞以外周神經、性腺、虹膜、各種臟器和皮膚組織發生單核細胞浸潤為主要特征[14]。此病在世界各地廣泛存在,是危害養雞業最為嚴重的傳染病之一,據估算每年引起的損失多達10億美元[15]。王秀花等[16]以MDV-1型超強毒株RBIB株的UL49基因編碼的被膜蛋白VP22為靶基因,設計了幾對siRNA,構建了相應的shRNA(短發卡siRNA的兩個短反向重復序列,中間由一莖環序列分隔的,組成發夾結構,由polⅢ啟動子控制)表達載體。將表達載體轉染CEF(雞胚胎成纖維細胞)后,接種MD病毒,結果表明轉染表達載體的細胞組對MDV抑制(蝕斑計數)率是96.8%,siRNA對此病毒具有明顯的抑制作用。Chen M等[17]針對MDV的gB糖蛋白基因和ICP4轉錄調控因子基因設計并構建了shRNA逆轉錄病毒表達載體,對其在細胞水平對MDV抑制作用的研究中發現,shRNA能夠顯著的抑制病毒的復制,不但病毒滴度有所下降,并且噬斑也顯著縮小,此外,筆者還將此載體改良為能夠攜帶3個特異性shRNA的載體,并且使其攜帶針對gB糖蛋白基因的多個位點或者gB糖蛋白基因與ICP4基因位點相結合的shRNA,研究發現此方法能夠更有效的抑制病毒的復制,并且能夠有效的避免因病毒變異造成的逃避作用。此后,筆者又進行了體內試驗[18],首先在0日齡雞胚中接種shRNA反轉錄病毒載體,孵化后1日齡接種648A MDV毒株,隨后在接種后14 d進行毒血癥檢測,結果顯示雖然沒有在細胞培養時的效果那么明顯,但表達載體仍能夠顯著降低感染動物的病毒血癥,且抑制效果與感染動物對病毒的抵抗力和敏感度有關,上述結果表明,無論在細胞水平還是在活體水平,RNA i都能夠有效的抑制MDV的復制,為MDV的預防與治療提供了新的思路。

3.2.3 新城疫 新城疫是由新城疫病毒(New castle virus,NDV)引起的雞和多種禽類的急性高度接觸性傳染病,以呼吸困難、下痢、神經紊亂等為主要特征。該病傳播迅速,死亡率高,是嚴重危害養禽業發展的重要疾病之一。疫苗在控制該病中發揮了重要作用,但由于新的基因型或抗原型病毒的出現,使現有的疫苗株保護力下降。因此,研究有效控制和減少免疫雞群中新城疫強毒感染與傳播的新技術具有重要意義。

岳華等[19]研究證實,發夾樣小干擾RNA(shRNA)表達載體可以特異性地抑制新城疫病毒在雞成纖維細胞中的表達,顯著降低新城疫病毒在雞胚中的增殖。NP基因在新城疫病毒復制過程中起重要作用,以新城疫病毒NP基因為標靶設計1對siRNA干擾新城疫病毒NP基因在雞胚成纖維細胞中的表達,結果發現以質粒為載體編碼細胞內轉錄產生的shRNA能有效地抑制新城疫病毒NP基因的表達,使NP基因m RNA的水平下降81%,在48 h內完全阻止新城疫病毒的產生,而陰性對照組在16 h內就已出現明顯的細胞病變效應(CPE)。秦紅剛等[20]以新城疫病毒L蛋白的功能區(P1595、P2103和P3277酶活性中心結構區)序列為RNAi的靶位點,設計構建了3個特異性的siRNA真核表達質粒pSi-L6、pSi-L7和pSi-L9,轉染雞胚成纖維細胞后接種新城疫病毒。結果顯示,P基因和L基因的轉錄水平明顯下降,抗原蛋白的表達受到抑制,在轉染質粒的細胞培養上清液中病毒的效價也明顯降低,表明RNA i能夠有效的控制NDV的感染。

4 RNAi在重要人獸共患病治療及預防中的應用

4.1 禽流感

禽流感(Avian influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus,A IV)引起的一種急性傳染病,病死率很高,是危害禽業生產的一種常見病。隨著H 5N1亞型病毒感染人的病例開始增加,并不斷有死亡病例報道,對人類的健康構成威脅,受到廣泛關注。目前的治療與預防手段主要是應用疫苗和抗病毒藥物,但效果有限,需開發出新的治療方法。Zhou H等[21]針對禽流感病毒的保守區M 2和NP基因設計了siRNA,并對MDCK細胞和Balb/c小鼠進行干擾試驗,結果顯示在用 siRNA進行處理后,MDCK細胞能夠有效地抑制A型流感病毒的復制,使病毒感染后鼠的半數致死量下降0.51～1.63。對感染的小鼠接種pS-M 48和pS-NP1383干擾表達載體后,能夠顯著地降低肺中的流感病毒滴度并能夠保護部分小鼠免受致命的流感病毒感染,如H5N1(2/8)和H 1N1(4/8)型病毒。Li Y C等[22]制備了表達AIV基因組編碼的核糖核蛋白、核蛋白和PA序列的siRNA s,并通過評價這些siRNAs在MDCK、CFF和雞胚上沉默靶基因表達和對流感病毒誘導細胞凋亡的影響,研究了它們抗H 5N1流感病毒的特性。結果證明,在轉染細胞上這3種siRNA s表達質粒有效地轉錄了短發夾RNAs并分別抑制了NP和PA的表達。在轉染細胞上通過細胞病變、血凝試驗和蝕斑形成試驗檢測表明,siRNA表達質粒能有效地抑制流感病毒的合成,而且能顯著阻斷流感病毒誘導的細胞凋亡過程,保護感染細胞免受凋亡的損傷。這些方法說明RNAi具有成為治療和預防禽流感新方法的潛力。

4.2 狂犬病

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RA)引起的以致死性腦脊髓炎為特征的人獸共患病,一旦發病,病死率幾乎為100%,給畜牧業生產,特別是人類健康構成嚴重威脅。張守峰等[23]設計并構建了針對狂犬病病毒(RV)糖蛋白和核蛋白mRNA的共9個siRNA表達載體,轉染BHK-21細胞系后,在潮霉素-B的篩選壓力下,獲得9個穩定轉錄相關siRNA的BHK-21細胞株。1 000 TCID50的RV分別感染24孔板內的上述9株細胞,48 h后以直接免疫熒光法檢測各株細胞上RV的增殖。結果顯示,在經不同siRNA表達載體轉染的BHK-21細胞中,RV增殖水平有不同程度下降,RV增殖水平最低者為對照細胞的1%。針對其中的靶序列G69和N19,人工合成其雙鏈 siRNA,瞬時轉染BHK-21細胞后,仍可達到80%以上的感染阻斷率。為有效阻斷RV早期感染提供了新選擇。

4.3 口蹄疫

口蹄疫(Foot-and-m outh disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-m outh disease virus,FMDV)引起的偶蹄動物發生急性、熱性、高度接觸性的傳染病,為人獸共患病。口蹄疫有7個血清型,各個血清型之間無交叉反應,基因組RNA沒有單一準確的核酸序列,呈現類群分布,這種特性使得FMDV在變異和適應性方面具有極大的潛能,這些都給口蹄疫的預防和控制帶來了極大的困難。Joyappa D H等[24]最近報道了利用h7K RNA聚合酶Ⅲ啟動子構建了針對對FMDV復制較為重要的3D和5′UTR兩個區域的shRNA。結果顯示,構造的shRNA在BHK-21細胞和豚鼠體內對FMDV的復制均有明顯的抑制作用,當細胞被100個 TCID50的FMDV處理時,3D shRNA的轉染能夠使病毒的增長減少3倍。在1 000個TCID50的口蹄疫病毒處理時,80%的用3D shRNA預處理的豚鼠得到保護,研究認為,shRNA可以做為一個有效地手段來控制FMDV的感染和傳播。Yang B等[25]構建針對5′非編碼區和FMDV VPl基因的反義 RNA,首先將含有病毒RNA復制起始位點的口蹄疫病毒5′UTR反向插入pIRES載體以產生反義RNA,其次是插入口蹄疫病毒VPl基因產生重組質粒pAS-IR-VPl。用 pASIR-VPl質粒轉染的BHK-21細胞顯示一種很強的抵抗口蹄疫病毒感染的能力,用該疫苗免疫小鼠,免疫組小鼠T細胞增殖明顯高于未接受疫苗接種的對照組,接種21 d后收集血清,檢測發現接種小鼠T細胞增長為原來的64倍。此外,乳鼠接種該疫苗后6 h用FMDV攻毒,結果有50%～83%存活。結果表明,該疫苗能產生定位到5＇非編碼區和VPl結構區的反義RNA,并可誘導快速抑制病毒復制的作用,從而可以保護被口蹄疫病毒感染的小鼠。Kim SM等[26]報道了將RNA i技術分別在小鼠體內和體外進行治療性試驗,發現構建的siRNA能夠有效地治療并控制口蹄疫病毒的感染,為下一步 RNA干擾疫苗的研制奠定了基礎。

5 問題與展望

RNAi作為一種古老而保守的抗病毒機制廣泛存在于生物體,人們已經模仿這種機制開展許多相關的研究工作,并取得重大成就。但作為新的研究手段,仍面臨一些問題:①如何將其最終應用于臨床。目前的相關報道僅限于理論上的證實,且其證實過程全部在試驗條件下離體完成,鮮有將其真正應用于臨床的報道。②RNAi不能作用于所有基因和某些細胞類型(如神經元);③如何面對病毒為逃避RNA i機制所產生的突變,如:產生能與siRNA結合的蛋白等。

盡管RNAi作為新興的手段還存在一定的問題,但是隨著RNA干擾機制、傳輸系統和靶基因篩選等方面的不斷深入研究,一定能夠為RNA i作為新的基因治療劑掃清種種障礙,使其更加廣泛地應用于動物乃至人畜共患疾病的治療,最終成為防治動物疫病的有效手段。

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