轉基因表達的時空調控*

杜 麗,孟慶文,滿處日嘎,王鳳陽*

(1.海南大學農學院 海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室(籌) 海口市動物基因工程重點實驗室,海南海口570228;2.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室,黑龍江哈爾濱150001)

1982年Palmiter等將金屬硫蛋白(metalloprotein,MT)啟動子和生長激素基因拼接后導入小鼠受精卵的雄原核,獲得整合和表達該外源DNA的轉基因“碩鼠”,近年來轉基因動物技術已廣泛應用于生命科學研究的諸多領域[1-2]。

為了對轉基因表達產物的合成與加工進行動力學分析,尋找影響轉基因表達的相關因素,探究某些功能基因在模型動物一定發(fā)育階段的生理作用。從早期的金屬離子誘導、熱激、激素等調控系統(tǒng)到四環(huán)素誘導,以及基于多種組織特異性的啟動子的轉基因表達的調控系統(tǒng)相繼建立,并成為轉基因動物研究的一個重要組成部分[3-7]。下面對轉基因表達調控系統(tǒng)的研究進展進行綜述。

1 基于四環(huán)素(tetracycline,Tet)的調控系統(tǒng)(Tet on/off系統(tǒng))

該系統(tǒng)一般包括:①組織特異的啟動子、四環(huán)素反應轉錄活化因子(tet responsive transcriptional activator,tTA)或反式tTA(reverse tet responsive transcriptional activator,rtTA)組成的調控質粒;②由四環(huán)素操縱子(tet operator,TetO)、巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)啟動子、目的基因組成的響應質粒。通過兩輪轉染,經G418、潮霉素/嘌呤霉素篩選,建立相應的的穩(wěn)定細胞系,在培養(yǎng)基含有四環(huán)素(或強力霉素,doxycyclin)或不含有四環(huán)素(或強力霉素)的條件下,轉基因的表達受到調控[8-10]。

Tet on系統(tǒng)建立后,廣泛應用于酵母、果蠅、小鼠、大鼠、多種細胞系及植物。但是,在某些動物的某些器官,強力霉素一定程度的無效誘導,rtTA mRNA原核部分序列的不穩(wěn)定性,及其在強力霉素不存在的條件下,rtTA與TetO殘留的結合等因素所導致的靶啟動子的背景活性升高等缺陷在很大程度上限制了其應用。針對上述不足,Urlinger S等[11]以增強型綠色熒光蛋白(enhenced green fluorescent protein,EGFP)為報告基因,對運用PCR方法建立的突變rtTA DNA的文庫進行篩選,在酵母中得到了背景更低,敏感性更高的rtTA突變體-rt-TAs-M2。強力霉素誘導試驗表明,與野生型rtTA相比,rtTAs-M2對于強力霉素的需要量低10倍,而且更穩(wěn)定,無強力霉素時,無背景表達。

TetR在真核細胞中表達時,存在于TetR編碼區(qū)中部潛在的剪切方式會導致非必要mRNA的產生,為了解決這一問題,Stebbins M J等[12]去除了TetR基因中部的潛在剪切位點,同時在rtTA表達框兩側插入果蠅邊界元素,以消除整合位置對表達的影響,結果發(fā)現(xiàn),日糧中低水平的強力霉素(10 μ g/mL)可以有效、迅速誘導轉基因在果蠅模型的胚胎、幼蟲和成蟲等階段的表達。

為了探討超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,EC-SOD,Sod3)的病理生理作用,Zou Y等[13]通過將Sod3轉基因小鼠與可誘導的組織特異轉錄激活因子轉基因小鼠雜交,建立了四環(huán)素誘導的組織特異表達Sod3的轉基因小鼠,進一步的分析表明,肝特異性表達Sod3的轉基因小鼠EC-SOD水平增加,神經元特異表達Sod3的轉基因小鼠ECSOD水平在海馬和大腦皮層增加,小鼠食物中添加的強力霉素能夠開啟或關閉轉基因的表達。

2 基于酵母轉錄激活蛋白Gal4的時空調控系統(tǒng)

基于Gal4及其結合位點的上游激活序列(upstream activation sequence,UAS)建立的轉基因表達的時空調控系統(tǒng)一般包括:①由Gal 4的DNA結合結構域與人的雌激素受體的C端融合在一起的調控質粒;②數個UAS、TATA盒、目的基因組成的Gal 4響應質粒。整合有調控質粒和響應質粒的細胞或模型動物,在雌激素存在的情況下,Gal4的DNA結合結構域得到表達,并結合到響應質粒的UAS序列啟動靶基因的表達。由于絕大多數哺乳動物既不表達內源性的雌激素受體,也不表達任何Gal4樣活性的蛋白,因此,該系統(tǒng)具有較強的選擇性。

Braselmann S等[14]將單純皰疹病毒蛋白VP16的強激活結構域加入到調控質粒中,增強了Gal 4-ER的轉錄激活能力,并且消除了由于細胞系不同而導致的背景差異,同時構建了由4個Gal 4結合位點、小鼠Ⅱ型主要組織相容復合物的CCAAT盒、來自腺病毒晚期轉錄單位(—39～+15)的起始區(qū)和TATA盒組成的低背景、高響應的Gal4響應啟動子序列調控下的c-fos表達載體。將該表達載體短暫轉染NIH3T3和P19細胞系,培養(yǎng)基中加入雌激素,Gal 4-ER-VP16導致的響應啟動子的活性提高了100倍。在整合有調控質粒與響應質粒的大鼠成纖維細胞中加入雌激素1 h～2 h后,fos表達水平開始升高,并導致了該細胞系依賴雌激素的轉化。

為了在果蠅胚胎后發(fā)育階段在幼蟲神經肌肉接頭表達轉基因,Osterwalder T等[15]成功的建立了基于Gal4的條件性組織特異轉基因表達系統(tǒng)。首先,選擇了神經特異表達的胚胎致死異常視力樣基因(embryonic lethal abnormal vision,ELAV)的啟動子和肌肉特異表達的肌球蛋白重鏈基因(myosin heavy chain,MHC)的啟動子,建立組織特異性(突觸前或突觸后)表達基因開關(RU486依賴的孕激素受體-Gal4融合蛋白,GeneSwitch)的果蠅,并和表達UAS轉基因的果蠅交配,RU486可以開啟或關閉目的基因的轉錄及表達。將一定劑量的GeneS-witch激活劑-RU486混在食物中飼喂,或者經“幼蟲浴”(將第3齡期幼蟲置于一定濃度RU486環(huán)境下一定時間),GeneSwitch活化,UAS轉基因在突觸前后在一定的時間條件下得到表達。在表達狀態(tài)下,如果將果蠅移入無RU486的條件下,GeneS-witch介導的轉基因表達將關閉。在幼蟲發(fā)育的大部分時期,在激活劑不存在的情況下,UAS轉基因背景轉錄水平非常低。

Asakawa K等[16]利用T ol2轉座子,設計了GAL4基因陷阱方法,在轉基因斑馬魚的特定細胞表達Gal4。將Gal4轉基因魚和UAS-報告基因和效應基因轉基因魚雜交,使詳細分析斑馬魚基因在特定的細胞表達成為可行。

3 基于小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)的時空調控系統(tǒng)

在ES細胞未分化狀態(tài)下,干擾素(interferon)依賴的誘導系統(tǒng)能夠開啟/關閉氯霉素乙酰基轉移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)的表達,但IFN-β持續(xù)刺激ES細胞,非常可能影響其正常發(fā)育[17]。Zhang Y等[18]應用三苯氧胺(tamaoxifen)調控下的Cre重組酶(Cre recombinase)導致的Cre的重組,激活穩(wěn)定整合在ES細胞的β-半乳糖苷酶(LacZ),但三苯氧胺的用量遠遠超出了細胞生長與小鼠妊娠的中毒劑量,并且存在有持續(xù)的LacZ的背景表達。

Vallier L等[19]將Cre重組酶與突變的雌激素受體融合,構建了對4′-羥基三苯氧胺(4′OH-tamoxifen,4′OHT)高度敏感的調控質粒,同時還構建了受Cre重組酶調控,由內源性啟動子調控下的人堿性磷酸酶(human alkaline phosphatase,hAP)轉基因表達載體。經過藥物篩選(G418、潮霉素),整合有調控質粒和響應質粒的ES細胞在分化及未分化狀態(tài)下,在體內或體外,在非毒性4′-OH T的嚴格控制下均能表達轉基因hAP。

4 基于RNAi的時空調控系統(tǒng)

近年來,做為在轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平上阻斷基因表達的一種重要手段,應用RNAi技術建立可調控的轉基因動物模型方面的探索已經取得了很好的進展[20]。Higuchi M等[21]利用RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動子H1在AGS細胞系表達酪氨酸磷酸酶2(Src homology phosphatase-2,SHP-2),建立了異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(the lactose analogisopropyl-1-thio-beta-D-galactopyranoside,IPTG)誘導的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)表達系統(tǒng),SHP-2的表達受到調控。Wu R H等[22]建立的可誘導的siRNA表達系統(tǒng)能夠有效、有條件的調控基因的表達,在非誘導條件下,背景效應很低,在短暫轉染和穩(wěn)定細胞系,熒光素酶和P53的表達被條件性調控。

Kotnik K等[23]構建了靶向胰島素受體(insulin receptor,IR),四環(huán)素誘導短發(fā)夾RNA(short hairpin,shRNA)表達的轉基因基因抑制(knockdown)大鼠,強力霉素可以廣泛性抑制IR的表達及其信號通路,導致可逆的劑量依賴性的血糖增加,成功建立了可誘導的糖尿病大鼠模型。基于同樣的技術原理,Herold M J等[24-25]也分別成功構建了可誘導的轉基因大鼠和小鼠模型。

5 結語

在多種模式動物成功建立轉基因表達時空調控系統(tǒng)的同時,對誘導藥物的使用劑量、轉基因的基礎表達水平的掌握等方面還需要進一步的深入研究。隨著諸多基因功能背景的逐步澄清及一些相關技術的發(fā)展,在選擇最佳的模式動物,運用精細的技術手段,精確、嚴格的時空調控轉基因表達的研究領域,必將有更大的突破,并廣泛應用于生命科學研究。

[1] Palmiter R D,Brinster R E,Hammer M E.Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with a metallothionein-growth hormone fusion gene[J].Nature,1982,300(5893):611-615.

[2] 張 賀,王承利,王 洋.轉基因動物研究進展[J].動物醫(yī)學進展,2008,29(7):59-62.

[3] Zhu F,Parthasarathya R,Bai H,et al.A brain—specific cytochrome P450 responsible for the majority of deltamethrin resistance in the QTC279 strain of Tribolium castaneum[EB/02].

[4] 楊啟紅,陳 林,梁 勇.轉基因表達的調控方法[J].動物醫(yī)學進展,2003,24(4):49-51.

[5] Fukuda T,Mishina Y,Michael P,et al.Conditional transgenic system for mouse aurora a kinase:deg radation by the ubiquitin proteasome pathway controls the level of the transgenic protein[J].Mol Cell Biol,2005,25(12):5270-5281.

[6] Jin K,Wang X,Xie L,et al.Transgenic ablation of doubleco rtin-expressing cells suppresses adult neurogenesis and worsens stroke outcome in mice[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,12.[Epub ahead of print]

[7] Mitchell J C,Perkinton M S,Yates D M,et al.Expression of the neuronal adaptor protein X11alpha protects against memory dysfunction in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease[J].Alzhemiers Dis,2010,20(1):31-36.

[8] Kistner A,Gossen M,Zimmermann F,et al.Doxy cycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(10):10933-10938.

[9] Sheng Y,Lin C C,Yue J,et al.Generation and characterization of a Tet-On(rtT A-M2)transgenic rat[J].BMC Dev Biol,2010,10:17.

[10] Zhou H,Huang C,Yang M,et al.Developing tT A transgenic rats for inducible and reversible gene expression[J].Int J Biol Sci,2009,5(2):171-181.

[11] Urlinger S,Baron U,Thellmann M,et al.Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators:Novel mutations yield expanded range and sensitivity[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(14):7963-7968.

[12] Stebbins M J,Urlinger S,Byrne G,et al.Tetrancycline-inducible system for drosophila[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(19):10775-10780.

[13] Zou Y,Chen C H,Fike J R,et al.A new mouse model for temporal-and tissue-specific control of extracellular superoxide dismutase[J].Genesis,2009,47(3):142-154.

[14] Braselmann S,Graninger P,Busslinger M.A selective transcriptional induction system for mammalian cells based on Gal4-estrogen receptor fusion proteins[J].Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(3):1657-1661.

[15] Osterwalder T,Yoon K S,White B H,et al.A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GA L4[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(10):12596-12601.

[16] Asakawa K,Kawakami K.The Toll-mediated Gal4-UAS method for gene and enhancer trapping in zebrafish[J].Methods,2009,49(3):275-281.

[17] Sangfelt O,Erickson S,Grander D.Mechanisms of interferon-induced cell cycle arrest[J].Front Biosci,2000,5:D479-487.

[18] Zhang Y,Riesterer C,Ayrall A M,et al.Inducible site-directed recombination in mouse embryonic stem cells[J].Nucleic Acids Res,1996,24(4):543-548.

[19] Vallier L,Mancip J,Markossian S,et al.An efficient system for conditional gene expression stem cells and in their in vitro and in vivo differentiated derivatives[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(5):2467-2472.

[20] Gao X,Zhang P.T ransgenic RNA interference in mice[J].Phy siology(Bethesda),2007,22:161-166.

[21] Higuchi M,Tsutsumi R,Higashi H,et al.Conditional gene silencing utilizing the lac repressor reveals a role of SHP-2 in cag A-positive Helicobacter pylori pathogenicity[J].Cancer Sci,2004,95(5):442-447.

[22] Wu R H,Cheng T L,Lo S R,et al.A tightly regulated and reversibly inducible siRNA expression system for conditional RNAi-mediated gene silencing in mammalian cells[J].J Gene M ed,2007,9(7):620-634.

[23] Kotnik K,Popova E,Todiras M,et al.Inducible transgenic rat model for diabetes mellitus based on shRNA-mediated gene knockdown[J].PLoS One,2009,4(4):e5124.

[24] Herold M J,van den Brandt J,Seibler J,et al.Inducible and reversible gene silencing by stable integration of an shRNA-encoding lentivirus in transgenic rats[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(47):18507-18512.

[25] Seibler J,Kleinridders A.Reversible gene knockdown in mice using a tight,inducible shRNA expression system[J].Nucleic Acids Res,2007,35(7):e54.