豬繁殖與呼吸綜合病毒結構蛋白2b研究進展*

李 勇,夏志平,高英杰,馬德慧

(1.解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所重點實驗室,吉林長春130062;2.吉林大學畜牧獸醫學院,吉林長春130062;3.內蒙古民族大學動物科技學院,內蒙古通遼028042)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒,病毒粒子呈球形,直徑為55 nm～60 nm,屬于尼多病毒目(Nidovirales)動脈炎病毒科(Ateriviridae)動脈炎病毒屬(Arterivirus),同一家族的病毒還有馬動脈炎病毒(Equine Arteritis virus,EAV)、鼠乳酸脫氫酶增高癥病毒(Lactate dehydrogenase-elevating virus,LDV)和猴出血熱病毒(Simian hemorrhagic fever virus,SHFV)。根據病毒基因組核苷酸序列的不同,可將PRRSV分為2個基因型,即北美洲型(VR 2332)和歐洲型(LV)。目前我國發現的基因型均與美洲基因型的親緣性接近。PRRSV全基因組長約15 kb。整個基因組含有9個開放閱讀框架,分別為ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7,其中ORF2～ORF7編碼病毒結構蛋白,ORF1a和ORF1b編碼具有聚合酶和解旋酶活性的非結構蛋白。Wu H F等[1]發現了一個不屬于PRRSV任何已知開放閱讀框編碼的多肽,經研究該蛋白與EAV E蛋白生物學功能很相似,并命名為2b蛋白。

1 2b蛋白的發現及命名

1999年,Snijder E J等[2]報道在EAV內發現了E蛋白,一種新的結構蛋白,是由ORF2雙順反子編碼,E蛋白的翻譯起始密碼子位于ORF2a起始密碼子下游的兩個核苷酸。與EAV E基因相似,對PRRSV進行基因組分析,發現ORF2中存在小的內部重疊閱讀框ORF2b,編碼一個分子質量為10 ku的蛋白,為了不與大結構蛋白GP5(E蛋白)混淆,將該蛋白命名為2b蛋白與之相區分。由于ORF2b的發現,故將原來的ORF2命名為ORF2a。

2 分子生物學特征

mRNA2同時編碼ORF2a和ORF2b,則呈現為雙順反子(dicistronic)。ORF2b位于ORF2a內部,起始密碼子位于ORF2a起始密碼子下游的第6個核苷酸處。美洲型毒株ORF2b基因全長222 bp,編碼73個氨基酸;歐洲型毒株ORF2b全長213 bp,編碼70個氨基酸。2b蛋白非糖基化并與包內膜結合,包括一個C末端親水氨基酸簇,有趣的是尼多病毒目其他動脈炎病毒,同樣能編碼小的疏水性囊膜,在病毒形態形成過程中發揮重要作用[3]。北美洲型病毒2b蛋白具有保守的豆蔻?；虲K-Ⅱ磷酸化位點,在49和54核苷酸處包含兩個半胱氨酸殘基,其對病毒增殖是非必需的。研究發現2b蛋白并不能以二硫鍵的方式形成同型二聚體[4]。通過對感染豬血清中抗體的檢測,證實歐洲型2b蛋白與GP2-GP3-GP4異質三聯體結合,一起被整合到病毒體內,并在異質多聚體進入病毒過程中扮演重要的角色[5]。通過與GenBank中序列比對分析,發現北美洲毒株擁有第二個潛在的起始密碼子,位于ORF2bAUG下游第9個核苷酸處,但它并不是一個翻譯起始點,對2b蛋白的結構形成沒有影響。在蛋白所有氨基酸中,發現第3、7、48、50、62處氨基酸較易發生突變,除第50和62位氨基酸突變影響2b蛋白結構外,其他突變因發生的都是同義突變而不影響蛋白結構的完整性。

3 生物學功能

2b蛋白作為新蛋白,其生物學功能需要不斷的深入和完善。目前認為2b蛋白在病毒感染過程中起作用。交聯實驗證明,2b蛋白能通過非共價鍵與其他蛋白結合形成同型寡聚體,包括二聚體、三聚體和四聚體。而2b與N蛋白的結合仍需要進一步證實。為了進一步驗證2b蛋白的生物學功能,用基因敲除的方法去除ORF2b的起始基因,2b蛋白不能表達,而PRRSV喪失感染細胞的能力GP2b-GP3-GP4三聚體不能進入病毒體內,缺少了任何一種小結構蛋白將減少2b蛋白聚合體進入病毒體的數量[6-7]。將沒有了感染性的病毒進行細胞培養時,發現病毒仍然能通過受體介導的內吞作用進入細胞,并在胞內形成包涵體,使基因組不能釋放,復制過程受阻[8]。此時胞內酸性環境使病毒膜蛋白發生構象變化,暴露出隱藏的促膜融合蛋白結合區域,使病毒囊膜和內涵體膜發生了融合(哪種細胞器引發了胞內酸性環境還不清楚),接著發生脫殼過程。脫殼是病毒感染的關鍵步驟,此步驟發生在衣殼破解,釋放基因組進入細胞質并開始復制的過程中。有趣的是,不是PRRSV與細胞膜直接融合,也沒有關于動脈炎病毒屬具有促膜融合蛋白特性的報告。推測PPRSV可能有跨膜蛋白促進病毒感染早期內涵體的脫殼過程。應用一種抗流感病毒的藥物金剛烷胺來驗證其對PRRSV的阻斷效果,電鏡下觀察發現PRRSV不能進行復制,表明PRRSV的確擁能夠編碼具有離子通道活性的蛋白,其活性是在感染時進行脫殼所必需的[9]。研究證明,2b蛋白能促進病毒粒子脫殼,而在粒子組裝和釋放中并沒有發揮很大的作用。

2b蛋白主要集中在細胞核區,包圍在內質網和高爾基體,與核膜相連。動脈炎病毒屬病毒2b蛋白能夠改變膜通透性,形成一種類似人工膜一樣的通道,具有陽離子選擇透過性。Lee C等[10]研究數據表明,PRRSV 2b蛋白能改變菌膜通透性,抑制細菌的生長,并能增加潮霉素B進入細胞的幾率。然而用病毒感染或者2b基因轉染哺乳動物細胞,卻不能得到相同的結果,可能是由于2b基因在哺乳動物細胞內的定位不同。在PRRSV感染的Marc-145細胞內,2b蛋白出現在內質網和高爾基體上,有可能參與子代病毒的加工過程,而不是移動到細胞膜上。細菌體內沒有細胞器,表達的2b蛋白則聚集在細菌內膜上,導致膜變性,因此增加了膜的透過性。2b蛋白沒有改變哺乳動物細胞膜通透性,說明病毒進入細胞時膜結構破壞和細胞溶解不是2b蛋白的作用[11]。目前的研究證實,PRRSV 2b蛋白具有潛在的形成病毒孔的活性,有使病毒脫殼的離子通道的功能。然而,由2b蛋白介導的病毒感染細胞的離子通道類型(如Na+、K+、Ca2+、Cl—、H+等)還沒有被確定。

4 免疫學特性

豬感染PRRSV后,體內能產生一系列的抗該病毒的特異性抗體,但體液免疫在免疫保護作用中的機制尚不完全清楚。在感染后的5 d～7 d出現抗PRRSV的IgM,隨后的1周～2周消失;7 d～10 d后檢測到抗PRRSV的IgG,之后1周～3周達到頂峰,并持續數月;抗PRRSV的IgA在感染后14 d首次檢測到,24 d后達到最大值,38 d后消失[12]。2b蛋白特異性抗體首次出現在感染后第18、39天后達峰值,具有抗2b活性和免疫中和活性。當感染后25 d,幾乎所有感染的豬都能檢測到中和抗體,但滴度很小,中和抗體低是PRRSV感染的典型特點[13]。2b蛋白能促進IFN-γ的表達,可抑制在巨噬細胞中的復制,影響病毒蛋白的正常合成,還能增強巨噬細胞產生超氧陰離子的能力。用病毒接種細胞發現接種后大約6 h出現GP5,M,N蛋白,而2b蛋白在接種后15 h才大量出現,綠色熒光跟蹤標記2b和GP2融合蛋白,結果顯示兩種蛋白都能表達,然而2b優先表達,是ORF2表達的主要產物[14]。

5 結語

2b蛋白不是病毒裝配所必需的,但能促使PRRSV粒子脫殼,釋放RNA到宿主細胞內,具有影響病毒復制的作用,因此對其功能的研究非常重要。作為一種離子通道蛋白,2b蛋白的功能和結構特征與A型流感病毒M2蛋白很相似,M2蛋白與病毒囊膜形成同型四聚體,具有典型的離子通道活性。通過M2通道移動使病毒體內形成酸性環境。結果M1蛋白從核蛋白復合體上分離下來,促進核蛋白復合體進入細胞核,流感病毒在此進行復制[15]。病毒離子通道的研究是病毒病治療性藥物篩選的主要方法和手段,為國內外研究的熱點,目前主要集中在流感病毒、丙型肝炎病毒、SARS病毒等的研究上[16-17]。

PRRS目前沒有特效治療藥物,人們更重視其免疫機理及疫苗研究,防止病毒侵入機體,以及抑制病毒在體內的復制成為防控該病的主要方向。2007年,我國南方地區發生的高致病性藍耳病,最初被認為是由非結構蛋白Nsp2缺失了30個氨基酸使病毒毒力增強所致,試驗證明事實并非如此[18]。我們假想2b蛋白的突變或其高級結構的變化使宿主細胞的膜通透性增強導致PRRSV的感染力增強,因此通過對該蛋白的研究,篩選出特效阻斷性藥物,以應對PRRSV抗原漂移和變異帶來的后果,彌補當前PRRSV疫苗保護不力的現狀。

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