移植物抗宿主病的細胞治療

郝 磊綜述，陳幸華審校

(第三軍醫大學新橋醫院血液科，重慶 400037)

異基因造血干細胞移植是目前治療血液系統惡性疾病的有效方法。以前認為其成功機制在于移植前后的化療或放療對腫瘤細胞的殺傷作用。目前一致認為，供體T細胞可以誘導殺死惡性細胞，即移植物抗白血病反應(GV L)，是異基因造血干細胞移植成功治療血液系統惡性疾病的關鍵所在。但是，供體淋巴細胞在殺死受體惡性細胞的同時，可以識別受體細胞表面的主要組織相容性抗原和次要組織相容性抗原，損害受體正常組織，即移植物抗宿主病(GVHD)。GVHD是導致異基因造血干細胞移植患者發病和病死的主要原因，成為阻礙移植成功的關鍵因素。

理論上，尋找與受體人白細胞抗原(HLA)配型相合的供體是預防GVH D發生的根本措施，然而即使HLA相合的同胞供體移植，也會因受體次要組織相容性抗原的識別導致GVHD的發生。當前，GVHD的預防性治療包括移植物T細胞去除(TCD)和免疫抑制劑的應用。免疫抑制劑具有強烈的不良反應，TCD顯著降低了供體T細胞的有利作用如增強植入、控制機會性感染和抗腫瘤效應。這些措施的應用在控制GVHD的同時，也削弱了GVL效應，使惡性腫瘤復發率增高。GVHD和GVL效應的有效分離是異基因造血干細胞移植需要解決的關鍵問題，成為醫學研究的焦點。本文對GVHD的發生、發展以及目前有望解決這一難題的細胞治療進行綜述。

1 GVHD的發生機制

發主GVH D的3個條件:(1)移植物必須是有免疫活性的細胞;(2)移植物供者缺少宿主帶有的同種杭原;(3)宿主不對移植物產生有效的免疫反應。GVHD的發生、發展主要分為3個階段:(1)造血干細胞移植前的預處理包括化療和放療，雖然可以最大程度地殺滅宿主體內的腫瘤細胞，但同時造成其他組織如胃腸道、肝臟等的損傷，導致炎性細胞因子 TNF-α、IL-1、IL-6等大量釋放。這些細胞因子增強宿主主要組織相容性復合體抗原(M HC)、黏附分子以及趨化因子的表達，還可以提高供者T細胞異源反應性的敏感度。經損傷的胃腸道進入機體的細菌脂多糖(LPS)進一步加重了炎性細胞因子的釋放。(2)在宿主抗原提呈細胞(APC)或非 APC直接提呈以及供體APC的間接提呈抗原的作用下，供者的 T細胞表面受體(TC R)識別APC表面的M HC-抗原肽分子后發生交聯(第一信號)，同時APC表面共刺激分子如CD80和CD86等和T細胞表面CD28分子結合(第二信號)，在雙信號的刺激作用下，T細胞激活、增殖、分化為效應 T細胞和記憶T細胞。(3)表達組織特異性黏附分子和趨化因子受體的抗原特異性T細胞遷移至表達多種黏附分子和趨化因子的外周組織，即GVHD的靶器官如皮膚、胃腸道和肝臟等。Th1型細胞分泌的細胞因子不僅誘導細胞毒性T淋巴細胞(CT L)和NK細胞的激活，還進一步激活單核吞噬細胞系統，增強炎性細胞因子的再次釋放，同時一氧化氮(NO)的釋放也增加。因此，除了CTL和NK細胞介導的Fas/FasL途徑和穿孔素/顆粒酶途徑對GVHD靶器官造成直接損傷外，非特異性炎性細胞因子也促進了器官特異性病理變化。

2 基因多態性和GVHD

對于相關和無關異基因造血干細胞移植，GVHD的發生主要與HLA不合有關。一項最大的關于供受體之間HLA相合的分析表明:HLA-A、HLA-B、HLA-C和 DRB1不相合時，病死率顯著增加[1]。除了已經確認的HLA-A和HLA-B不相合可以導致GVHD以外，臨床數據表明，不同 HLA-C和HLA-B等位基因，因表達異源反應性NK細胞表面KIR抑制性受體的配體，參與單倍同一性無關HSCT的GVHD和GVL效應，KIR配體不相合時，特別是急性髓細胞性白血病，GVHD的發生率降低，總體生存率提高。雖然HLA完全相合是成功移植的最佳條件，但是大多數患者無法得到配型完全相合的供體，識別可允許不合的特異性H LA等位基因，將有利于多數需要異基因造血干細胞移植的患者。

盡管采用高分辨率HLA分型，急性GVHD仍然是HLA相合異基因造血干細胞移植病死率的主要原因。此時，供體T細胞識別與之有差異的宿主次要組織相容性抗原(m HAg)，m HAgs是與主要組織相容性復合物結合的多態性肽，來源于細胞內蛋白，可以普遍表達或造血系統限制性表達。移植前、后大量細胞因子合成，即“細胞因子風暴”。大多數細胞因子基因包含遺傳性多態性，多態性是一些短核苷酸序列，呈現可變數量的重復(可變數量的串聯重復或微衛星)或單個核苷酸多態性。位于基因啟動子轉錄結合位點，改變基因轉錄，從而調節炎性刺激導致的細胞因子的產生。因此，健康人群中存在細胞因子表達量的差異。研究最早的是TNF和IL-10基因多態性與發生急性GVHD危險和嚴重度之間的關系[2]。TNF是急性GVHD過程中上調的重要細胞因子，IL-10拮抗TNF的釋放及功能。在HLA相合的異基因造血干細胞移植中，推測高表達人群濃度增高的TNF-α促進了GVHD的發生，由于IL-10的低表達，不能完全下調GVHD反應。許多研究表明關于TNF和IL-10基因多態性以及受體基因和GVHD的關系具有生物學意義。與GVHD相關的其他細胞因子基因多態性包括IL-6基因啟動子功能多態性、IFN-γ內含子微衛星多態性以及IL-1基因家族多態性。

已經證實其他非 HLA編碼的基因如維菌藥物D受體(VDR)和雌激素受體(ER)對急性GVHD的發展也會產生影響，VDR內含子8區和ER內含子1區的多態性與GVHD的發生以及異基因造血干細胞移植后患者總體生存有關。

3 細胞治療和GVHD

3.1 間充質干細胞(MSC) Friedenstein等首次報道在骨髓基質中存在干細胞，隨后很多研究證實采用Friedenstein的方法分離得到的M SC可以向成骨、成軟骨、脂肪細胞、肌細胞、星形膠質細胞、內皮細胞和肺上皮細胞分化。MSC缺乏特異性表面標記，不表達 CD45、CD34和 CD31等造血和內皮細胞表面標記。據估計，其占骨髓有核細胞數的0.01%～0.001%。人MSC與胸腺上皮有共同的表面標志，它們表達與T細胞相互作用的黏附分子包括有 VCAM-1、ICAM-1及LFA-3，推測MSC可能對T細胞發育及免疫調節發揮作用。

很多動物實驗和臨床研究都證實異基因造血干細胞移植時同時輸注供體或第三者來源的MSC可以降低GVHD的發生率及嚴重程度。Gurevitch等的研究發現BALB小鼠在接受B6小鼠骨髓移植時，同時植入包括供鼠MSC在內的骨髓塊，其發生GVHD的危險度與沒有接受移植的對照組相比顯著降低。患急性淋巴細胞白血病的9歲男孩，進行骨髓移植后70 d出現Ⅳ度急性GVH D，免疫抑制劑無效，73 d時靜脈輸注其母親骨髓來源MSC(2×106個/kg)，220 d時GVHD的癥狀完全消失，患者出院[3]。Lazarus[4]的臨床研究發現，46例患血液惡性疾病的患者行骨髓或外周血干細胞移植的同時，移植體外培養的MSC，13例患者(28%)出現Ⅱ～ Ⅳ度急性 GVHD，無病生存率達到53%。然而在最大的2項前瞻性研究中，Ⅱ～Ⅳ度和Ⅲ～Ⅳ度急性GVHD的發生率分別為44%～64%和12%～26%。深入證實MSC的有利作用有待進一步的隨機試驗。

輸注外源性MSC可以降低GVHD的發生率，其機制可能在于MSC對免疫細胞的抑制作用，包括T細胞、B細胞、NK細胞和APC。MSC分泌或免疫細胞受MSC刺激而分泌的一些可溶性分子包括肝細胞生長因子(HGF)、前列腺素 E2(PGE2)、轉化生長因子β(TGF-β)、吲哚胺 2，3 二氧酶(IDO)、NO和IL-10等參與了體外MSC的抑制作用[5-7]。最新研究還發現MSC分泌的HLA-G5是其發揮抑制作用所必需的[8]。根據MSC接受的刺激不同，比如異源性決定子、膜蛋白、有絲分裂劑或細胞因子等，分泌的可溶性分子也不同。細胞接觸方式也可能參與了抑制，如 MSC表面B7H1的表達[9]。

3.2 NK細胞 NK細胞是骨髓來源的大顆粒淋巴細胞，約占人外周血淋巴細胞總數的5%。是機體發揮天然免疫功能的重要組分，同時對獲得性免疫也起到一定調節作用。和 T、B淋巴細胞不同，NK細胞不表達抗原特異性受體，其功能的發揮主要依賴于NK細胞表面一系列抑制性和活化性受體，調節細胞的活性。NK細胞主要受自體MHCⅠ類分子特異性受體負性調節，當此受體不發生交聯時，靶細胞被裂解。因此，NK細胞的殺傷對象主要是一些不表達或低表達M HCⅠ類分子的靶細胞。同樣，當接觸不相合的異源靶細胞時，NK細胞識別自體MHCⅠ類分子發生障礙，從而引起異源性反應(“丟失自我”學說)。NK細胞表面重要的抑制性受體包括殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)和殺傷細胞凝集素樣受體 CD94/NKG 2A。由于所有個體均表達CD94/NKG 2A的配體HLAE，因此，表達CD94/NKG2A的NK細胞不發生異源性反應。在人類，根據MHCⅠ類分子α1螺旋羧基末端的氨基酸不同，KIR識別3組 HLA等位基因配體，即 HLA-C組 1(Asn80)、HLA-C組2(Lys80)和HLA-Bw4。NK細胞異源性反應發生于KIR配體不相合時。

在F1H-2d/b→H-2b移植動物模型中，移植前輸注供體抗受體異源性NK細胞后，受體可以接受含有超過致死劑量30倍的異源T細胞的骨髓移植物，但卻沒有GVHD的病理證據，推測原因是表達H-2d特異性Ly49A-G2受體不表達H-2b特異性Ly49C/I受體的供體NK細胞被激活從而殺死受體APC，而受體APC是啟動GVHD的重要細胞。體外實驗證實異源性NK細胞可以殺死急性髓細胞白血病(AML)、慢性髓細胞白血病、T細胞急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病和非霍奇金淋巴瘤細胞等[10]。臨床前期動物模型中，輸注異源性NK細胞可以消除NOD/SCID鼠移植的人AM L細胞。

單倍體相合移植時，在移植物抗宿主方向(GVH)KIR配體不相合情況下，供體NK細胞識別的自身HLAⅠ類分子在受體中沒有表達，抑制活化信號缺失，從而被激活，產生異源性反應。在KIR配體不相合的57例成年AM L患者，復發率降低的同時，GVHD的發生率也明顯降低。將HLA和KIR基因分型與NK細胞異源反應性功能鑒定相結合尋求單倍體相合供者的概率從30%增加到60%[11]。Ruggeri[12]研究還發現，85例接受單倍體移植的AML患者中，輸注供者異源反應性NK細胞組的GVHD明顯降低。100多例單倍體相合移植治療AML的研究證實，NK異源反應是患者生存改善的獨立預測因子。無關供體移植時，NK細胞異源反應增強了GVL效應[13]。

3.3 CD4+CD25+T細胞(T reg) 調節性CD4+CD25+T細胞(Treg)正常在胸腺中發育成熟，組成性表達CD25(IL-2受體α鏈)，在人類和鼠CD4+細胞中占5%～10%，MHCⅡ類分子的表達在其發育中發揮重要作用，調節自身免疫過程。Treg特異性表達轉錄因子FoxP3，與細胞發育及抑制功能有關，它的突變導致免疫失調。大量證據表明共刺激分子和細胞因子在T reg發育過程中發揮重要作用，但其具體機制不清楚。T細胞對自身抗原的耐受是在胸腺內發育過程中經過克隆刪除或誘導無能形成的，一些自身特異性T細胞可以逃逸到外周，此時需要外周免疫耐受機制控制T細胞反應。Treg保證了外周免疫耐受機制的正常發揮。在許多不同的Treg缺陷的動物模型中，觀察到多種T細胞介導的器官特異性自身免疫性疾病，且可以通過輸注Treg得到防治。體外實驗已經證實，當受到抗CD3單克隆抗體或異源APC刺激時，T reg呈現低反應性。Yamazaki[14]證實，體外Treg可以抑制混合淋巴細胞反應(M LR)。

發生異源性或自體GVH D的一個重要原因是外周免疫調節系統缺失，從而下調異源反應性或自體反應性T細胞的能力下降。因此，外周免疫調節系統的重建對GVHD的防治起關鍵作用。有學者比較了接受供體總T細胞和缺乏Treg的T細胞的受鼠中GVH D的發生率，結果表明移植物中缺乏Treg時顯著加速GVHD誘導的死亡，當共輸注T細胞和等量的Treg時，顯著推遲，甚至阻止了GVHD的發生。只有供體來源而非受體來源的Treg產生這種效應。Masteller等[15]比較了異源抗原擴增的T reg和多克隆Treg對受鼠GVHD發生的影響，結果表明，接受后者的受鼠脾臟、肺和肝臟出現組織學GVHD征象，而接受前者的受鼠沒有或僅殘留GVHD征象，因此，相對多克隆Treg，抗原特異性 Treg治療GVHD更加有效。但這并不意味著Treg對免疫反應的抑制是抗原特異性的，它的活化需要TCR的激活，活化的Treg在體外是以抗原非依賴性方式作用的。抗原特異性T reg可以避免大量輸注多克隆Treg造成的一些不良反應，如降低對腫瘤和感染的免疫等。在A20白血病模型中，CD8+而非CD4+T細胞體外可以裂解A 20細胞，而體外培養的T reg對CD4+T細胞的抑制作用更強[16]。所以，Treg抑制GVHD的效應比GVL的效應更強，它能將二者有效分開，但這需要進一步證實。

臨床BMT中 Treg對GVHD的調節作用的證據很少，Miura[17]的研究表明，與沒有 GVHD臨床癥狀的患者比較，發生GVHD的患者外周血淋巴細胞Foxp3 m RNA表達水平顯著降低，急性 GVHD患者中，Foxp3 m RNA表達水平和GVHD的嚴重程度負相關，認為CD4+CD25+Foxp3+T細胞在調節異源免疫反應中發揮重要作用。Sakagucki[18]研究了CD62L+和CD62-兩個不同CD4+CD25+調節性T細胞亞群與急性GVHD致死率的關系發現，當與供者CD4+CD25-T細胞一起移植時，僅CD4+CD25+CD62L+調節性T細胞亞群具有阻止嚴重組織損傷和保護受者免受致死性急性GVHD的作用。CD62L是非常重要的淋巴細胞歸巢受體及T細胞分化中的細胞表面分子。在移植早期，CD4+CD25+CD62L+調節性T細胞亞群較CD4+CD25+CD62L-調節性T細胞亞群能更多地進入宿主腸系膜淋巴結及脾臟內，調節性T細胞能夠進入這些致病性自身反應性T細胞聚集場所的能力是其具有避免急性GVH D發生的先決條件。

對Treg調節免疫反應的機制提出了很多觀點，包括釋放調節性細胞因子(如IL-10、TGF-β)，誘導T細胞無能以及反應性T細胞的凋亡等[19]。一致認為細胞之間的接觸是發揮其調節功能所必需的。

3.4 其他細胞 正常成熟樹突狀細胞(m DCs)是刺激T細胞免疫的強力APC，而正常不成熟樹突狀細胞(iDCs)參與外周T細胞免疫耐受的誘導。由于iDCs在炎癥刺激下可以轉變成m DCs，所以，不適于臨床上免疫疾病的治療。有學者分離出人和鼠調節性DCs(rDCs)，表達高水平的MHC分子，但共刺激分子表達量很低，激活異源反應性T細胞能力減弱，相反可以強烈誘導T細胞免疫耐受，即使在炎癥條件下，其免疫調節功能也不會降低。當骨髓移植后輸注宿主M HC相合rDCs時，急性GVHD導致的致死率顯著降低，對GVL的效應沒有明顯影響，rDCs對急性GVHD的控制在于體內誘導T細胞耐受以及對效應T細胞的直接抑制，且對CD4+T細胞的誘導免疫耐受的作用大于CD8+T細胞，而CD8+T細胞主要參與GVL效應，因此，輸注rDCs對GVL效應的影響不大。

影響GVHD和GVL的T細胞功能上至少存在4種，包括CD4+輔助性 T細胞(Th1和Th2)和 CD8+細胞毒性T細胞(Tc1和 Tc2)，Th1和 Tc1主要分泌Ⅰ型細胞因子(IL-2和IFN-γ)，而Th2和Tc2主要分泌Ⅱ型細胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)。Ⅰ型和Ⅱ型細胞因子的平衡對GVHD的發生、發展起到重要作用。Fowler和Gress[20]發現動物實驗中，輸注體外擴增的Th2/Tc2表型T細胞可以促進HLA不相合異源移植物的植入，降低GVHD的發生率，同時Th2/Tc2細胞通過穿孔素和顆粒酶途徑殺死腫瘤細胞。人特異性Tc1和Tc2在體外已經擴增成功，將進一步推進臨床應用。

[1]Flomenberg N.Impactof HLA classⅠand classⅡhighresolution matching on outcomes of unrelated donor bone marrow transplantation:HLA-C mismatching is associated with a strong adverse effecton transplantation outcome[J].Blood ，2004，104(7):1923.

[2]Dickinson AM.Genetic polymorphisms predicting the outcome of bone marrow transplants[J].Br J Haematol，2004，127(5):479.

[3]Le Blanc K.Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells[J].Lancet，2004，363(19):1439.

[4]Lazarus HM.Cotransplantation of HLA-identical sibling culture-expanded mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells in hematologic malignancy patients[J].Biol Blood Marrow Transplant，2005 ，11(5):389

[5]Sato K.Nitric oxide plays a critical role in suppression of T-cellproliferation by mesenchymalstem cells[J].Blood，2007，109(1):228.

[6]Beyth S.H uman mesenchymal stem cells alter antigenpresenting cell maturation and induce T-cell unresponsiveness[J].Blood，2005，105(5):2214.

[7]Aggarw al S，Pittenger MF.Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses[J].Blood ，2005，105(4):1815.

[8]Selmani Z.Human leukocyte antigen-G5 secretion by human mesenchymal stem cells is required to suppress T lymphocyte and natural killer function and to induce CD4+CD25 high FOXP3+regulatory T cells[J].Stem Cells，2008，26(1):212.

[9]Augello A.Bone marrow mesenchymalprogenitorcells inhibit lymphocyte proliferation by activation of the programmed death 1 pathway[J].Eur J Immunol，2005，35(5):1482.

[10]Caligiuri M A，Velardi A ，Scheinberg DA ，et al.Immuno-therapeutic approaches for hematologic malignancies[J].H ematology Am Soc Hematol Educ Program，2004:337.

[11]Ruggeri L.Natural killer cell recognition of missing self and haploidentical hematopoietic transplantation[J].Semin Cancer Biol，2006 ，16(5):404.

[12]Ruggeri L.Natural killer cells as a therapeutic tool in mismatched transplantation[J].Best Pract Res Clin Haematol，2004 ，17(3):427.

[13]Beelen DW.Genotypic inhibitory killer immunoglobulinlike receptor ligand incompatibility enhances the longterm antileukemic effectof unmodified allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in patients with myeloid leukemias[J].Blood，2005 ，105(6):2594.

[14]Yamazaki S.Effective expansion of alloantigen-specific Foxp3+CD25+CD4+regulatory T cells by dendritic cells during the mixed leukocyte reaction[J].Proc Natl Acad Sci USA ，2006，103(8):2758.

[15]Masteller EL，Tang Q，Bluestone JA.Antigen-specific regulatory T cells--ex vivo expansion and therapeutic potential[J].Semin Immunol，2006，18(2):103.

[16]Joffre O.Induction of antigen-specific tolerance to bone marrow allografts with CD4+CD25+T lymphocytes[J].Blood，2004 ，103(11):4216.

[17]Miura Y.Association of Foxp3 regulatory gene expression with graft-versus-host disease[J].Blood，2004，104(7):2187.

[18]Sakaguchi S.Naturally arising CD4+regulatory T cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses[J].Annu Rev Immunol，2004，22:531.

[19]Piccirillo CA，Thornton AM.Cornerstone of peripheral tolerance:naturally occurring CD4+CD25+regulatory T cells[J].Trends Immunol，2004 ，25(7):374.

[20]Fow ler DH，Gress RE.Th2 and Tc2 cells in the regulation of GVHD，GVL，and graft rejection:considerations for the allogeneic transplantation therapy of leukemia and lymphoma[J].Leuk Lymphoma，2000，38(3/4):221.