基因芯片技術(shù)在基因突變?cè)\斷中的應(yīng)用及其前景＊

朱曉娥 綜述,袁耿彪審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 400010)

基因芯片技術(shù)在基因突變?cè)\斷中的應(yīng)用及其前景＊

朱曉娥 綜述,袁耿彪△審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 400010)

基因突變;基因芯片技術(shù);甲狀腺癌

基因芯片診斷技術(shù)是伴隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的實(shí)施而發(fā)展起來(lái)的生命科學(xué)領(lǐng)域里的前沿生物技術(shù)。它最顯著的特點(diǎn)是高通量、高集成、微型化、平行化、多樣化和自動(dòng)化。經(jīng)過(guò)短短十幾年的發(fā)展,基因芯片技術(shù)現(xiàn)已在基因表達(dá)分析、基因突變及多態(tài)性分析、疾病基因診斷、新藥設(shè)計(jì)、藥物及毒物基因組學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域顯示出重大的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,具有廣闊的前景。人類(lèi)基因組大約由3×109個(gè)核苷酸對(duì)組成,其中約5%的DNA為基因編碼序列,共編碼5～10個(gè)基因。在機(jī)體內(nèi)外環(huán)境因素的作用下,或者有些基因損傷等而發(fā)生變異,即出現(xiàn)各式各樣的基因突變。基因突變是指基因組DNA序列中1個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的堿基發(fā)生突變、缺失、插入等現(xiàn)象,單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism s,SNP)是指在進(jìn)化過(guò)程中,由基因組核苷酸的變異引起的DNA序列差異,包括堿基的缺失、插入以及單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或顛換,是導(dǎo)致遺傳性疾病和腫瘤的重要原因之一[1]。本文對(duì)基因芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)中,尤其在甲狀腺癌診斷中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

20世紀(jì)末人類(lèi)基因組計(jì)劃(human genome p roject,HGP)的完成,極大地帶動(dòng)了人類(lèi)疾病相關(guān)基因以及病原微生物基因的定位、克隆、結(jié)構(gòu)與功能研究。基因芯片就是在這個(gè)背景下發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)分子生物學(xué)新技術(shù),因具有與芯片相似的微型化和大規(guī)模分析、處理生物信息的特點(diǎn)而得名,它能在一塊或若干塊芯片上完成生物樣品的分離、制備、生化反應(yīng)的進(jìn)行,如:核酸產(chǎn)物的分離(separation of nucleic acid p roducts)、雜交(hybridization)以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)等諸多生物學(xué)過(guò)程,顯示出快速、高效率、高通量處理生物學(xué)信息的能力。基因芯片技術(shù)又稱(chēng)DNA微陣列技術(shù)。該技術(shù)為了解人類(lèi)疾病提供了一個(gè)革命性的技術(shù)平臺(tái),為新假設(shè)的提出奠定了基礎(chǔ),被認(rèn)為是繼基因克隆技術(shù)、基因測(cè)序技術(shù)和PCR技術(shù)后的又一次革命性的技術(shù)突破[2]。

1 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是生物芯片技術(shù)中最基礎(chǔ)的,也是發(fā)展最成熟以及最先進(jìn)入應(yīng)用和商品化的領(lǐng)域。基因芯片又稱(chēng)為DNA芯片、DNA微陣列,基于核酸互補(bǔ)雜交原理所研制的[3]。基因芯片是采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣方法,將核酸片段以預(yù)先設(shè)計(jì)好的排列方式固化在固相支持物(硅片、玻片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體)的表面,組成密集二維分子排列,利用核酸雜交原理,通過(guò)激光共焦掃描及分析軟件,可對(duì)上千種基因的表達(dá)水平、突變和多態(tài)性進(jìn)行快速、并行、準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)分析[4]。

1.1 基因芯片技術(shù)的基本類(lèi)型

1.1.1 光引導(dǎo)原位合成技術(shù) 采用照相平板印刷技術(shù),結(jié)合光引導(dǎo)原位寡聚核苷酸合成技術(shù),制作和生產(chǎn)寡聚核苷酸微陣列芯片。二者的結(jié)合為合成高密度核酸探針及短肽列陣提供了一條快捷的途徑。這種技術(shù)生產(chǎn)的基因芯片可以達(dá)到106/ cm2的微探針排列密度,能夠在一片1 cm多見(jiàn)方的片基上排列幾百萬(wàn)個(gè)寡聚核苷酸探針,不僅可以用于寡聚核苷酸的合成,也可用于合成寡肽分子。

1.1.2 微電子芯片[5]電子芯片是由美國(guó)Nanogen公司開(kāi)發(fā)的,采用多位點(diǎn)電控陣列并含獨(dú)立可尋址檢測(cè)區(qū)域的微電子基因芯片,其基質(zhì)全部以硅、鍺為基礎(chǔ)的半導(dǎo)體材料,在其上構(gòu)建25～400個(gè)μPt電極位點(diǎn),各位點(diǎn)可由計(jì)算機(jī)獨(dú)立或組合控制。無(wú)論在芯片制造或成品芯片檢測(cè),均可通過(guò)相似微電極的電場(chǎng)變化來(lái)使核酸結(jié)合,引入“電子嚴(yán)謹(jǐn)度”參數(shù)使芯片檢測(cè)通過(guò)靶、探針序列特征和使用者要求來(lái)控制雜交過(guò)程中的嚴(yán)格性。

1.1.3 微量點(diǎn)樣技術(shù) 目前大部分生產(chǎn)基因芯片的單位都是使用這一方法,采用了更加微量的點(diǎn)樣技術(shù),可以點(diǎn)更加微量的探針。將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段有規(guī)律地排列固定于支持物(如膜、硅片、陶瓷片及玻片)上,然后通過(guò)類(lèi)似于No rthern、Southern印跡交雜技術(shù)的方法與待測(cè)的標(biāo)記樣品按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交,再通過(guò)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行掃描,并用相應(yīng)軟件對(duì)信號(hào)進(jìn)行比較和檢測(cè),得到所需的大量信息,進(jìn)行基因的高通量、大規(guī)模、平行化、集約化的信息處理和功能研究。其主要優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便宜行,技術(shù)要求較低,并且探針不受探針?lè)肿哟笮》N類(lèi)的限制,能夠靈活機(jī)動(dòng)地根據(jù)使用者的要求制作出符合目的的芯片。

1.1.4 其他技術(shù) 美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(N IH)、測(cè)徑器公司和O rchidbio公司研制了一種毛細(xì)管微流泵芯片[6],在邊長(zhǎng)2英寸的芯片上集成了144個(gè)微室,分別由流入孔、反應(yīng)室、循環(huán)管和廢液流出孔組成,這種芯片不但可以用于基因診斷和分析,還可用于化學(xué)合成。

1.2 基因芯片技術(shù)的基本步驟

1.2.1 光蝕刻合成法 是最初常用的一種方法,其主要過(guò)程是在固相支持物上耦聯(lián)帶有可感光保護(hù)基團(tuán)X的羥基,汞光有選擇地照射到固相支持物。去掉可感光保護(hù)基團(tuán)X,使羥基成為有功能的自由羥基,與加入的帶X的核苷酸耦聯(lián),第一個(gè)反應(yīng)物嫁接到目標(biāo)位置上。隨著反應(yīng)的重復(fù),鏈不斷地延伸,當(dāng)所需的寡核苷酸鏈合成完后,對(duì)反應(yīng)基板進(jìn)行無(wú)遮板的汞光普照,去除所有的X,即可得到所需的寡核苷酸陣列。這樣,光照模式和反應(yīng)物的加入順序決定了合成產(chǎn)物的序列以及在基板上的位置。該法可以合成30個(gè)堿基左右,其優(yōu)點(diǎn)在于精確性高,缺點(diǎn)是制造可感光保護(hù)劑價(jià)格較為昂貴。該法由美國(guó)的Affymetrix公司首先開(kāi)發(fā)采用。目前該公司已開(kāi)發(fā)成功能同時(shí)檢測(cè)6 500個(gè)已知人類(lèi)基因的DNA芯片。

1.2.2 壓電印刷法 其原理類(lèi)似于噴墨打印機(jī),打印機(jī)頭的墨盒有4個(gè),分別裝有4種不同的堿基,打印機(jī)頭在方陣上移動(dòng),并將帶有某種堿基的試劑滴到基板表面,然后固定。經(jīng)過(guò)洗脫和去保護(hù)后,就可以連接新的核苷酸,使寡核苷酸鏈延伸。該法使用的技術(shù)原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成相一致。壓電印刷法可以合成40～50個(gè)堿基,此法效率高但工藝不太成熟,目前該法主要由美國(guó)的Incyte Pharmaceuticals公司采用。

1.2.3 點(diǎn)樣法 即預(yù)先合成寡核苷酸,肽核苷酸或分離得到互補(bǔ)DNA(cDNA),再通過(guò)點(diǎn)樣機(jī)直接將其點(diǎn)到芯片上。寡核苷酸或肽核苷酸的合成主要是通過(guò)多孔玻璃合成法。肽核苷酸雖然在制備上比較復(fù)雜,但是它與DNA探針相比,由于戊糖核酸(PNA)與DNA結(jié)合的復(fù)合物更加穩(wěn)定和特異,因而更加有利于單堿基錯(cuò)配基因的檢測(cè)。來(lái)自某一細(xì)胞的cDNA必須進(jìn)行預(yù)處理、純化、擴(kuò)增以及分類(lèi)。然后再利用機(jī)械手把它們準(zhǔn)確地固定在基板的相應(yīng)位置上。為了保證cDNA芯片檢測(cè)的準(zhǔn)確性,在制備cDNA芯片以前必須提高低表達(dá)基因cDNA的豐度,降低高表達(dá)基因cDNA的豐度。點(diǎn)樣法的優(yōu)點(diǎn)在于成本低、速度快,但缺點(diǎn)是構(gòu)成方陣的寡核苷酸或cDNA片段需事先純化。目前采用該法的公司最多,有英國(guó)Brax Genomics Limited公司和美國(guó)Hyseq、Molecular Dynamics、Nanogen等多家公司[7]。

1.3 樣品的制備 生物樣品成分往往比較復(fù)雜,所以在與芯片接觸前必須對(duì)樣品先行處理。為了提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,來(lái)自血液或組織中的DNA/mRNA樣本須先行擴(kuò)增,然后再被熒光素或同位素標(biāo)記成為探針。

1.3.1 雜交 影響雜交的因素很多,但主要是時(shí)間、溫度及緩沖液的鹽濃度。如果是表達(dá)檢測(cè),需要長(zhǎng)歷時(shí)、低溫和高鹽條件的較嚴(yán)謹(jǐn)性雜交。而如果是突變檢測(cè),需要短歷時(shí),高溫和低鹽條件的高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交。總之,雜交條件的選擇,要根據(jù)芯片上核酸片段的長(zhǎng)短及其本身的用途來(lái)決定。

1.3.2 雜交圖譜的檢測(cè)和讀出 目前最為常用的是激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng),其原理主要是與芯片發(fā)生雜交的探針上的熒光被激發(fā)后經(jīng)過(guò)棱鏡剛好能通過(guò)共聚集小孔,而能被探測(cè)器檢測(cè),而芯片之外的其他熒光信號(hào)則不能被探測(cè)器檢測(cè)到,檢測(cè)到的熒光信號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理后就可直接讀出雜交圖譜。此法靈敏度和精確度較高,但是掃描所需時(shí)間較長(zhǎng)。另一種檢測(cè)系統(tǒng)采用電荷耦合裝置(CCD)攝像原理,它雖然靈敏度和精確度較低,但所需的掃描時(shí)間較短,因而更適用于臨床診斷。此外,近年來(lái)還發(fā)展了多種檢測(cè)方法,如質(zhì)譜法,化學(xué)發(fā)光法,光導(dǎo)纖維法等多種方法,其中最有前途的是質(zhì)譜法。

2 基因芯片在基因突變中的應(yīng)用

基因芯片是在基因組水平上發(fā)現(xiàn)并研究基因功能的有力工具。1996年Lockhart用于分析m RNA的表達(dá)水平時(shí),只能檢測(cè)1 000個(gè)基因。而現(xiàn)在寡核苷酸芯片可以攜帶目前已知的所有基因(達(dá)到38 500個(gè))的探針口,在1次試驗(yàn)中可以檢測(cè)20 000～100 000個(gè)基因。現(xiàn)已廣泛用于疾病機(jī)制的研究、疾病的分類(lèi)和診斷、疾病的預(yù)測(cè)和治療。

2.1 基因芯片在甲狀腺癌(TC)相關(guān)基因突變中的應(yīng)用 TC是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的一類(lèi)惡性腫瘤,約占人類(lèi)全部惡性腫瘤的1%。常見(jiàn)的4種病理類(lèi)型中,約80%的乳頭狀癌中有V型鼠科肉瘤病毒B1的同源致癌基因(BRAF)突變(45%)、甲狀腺乳頭狀癌的轉(zhuǎn)染(RET/PTC)重排(20%～80%)和宿主細(xì)胞基因組(RAS)突變(10%～20%),但很少在同一個(gè)病灶中共存。約15%的濾泡狀癌中,常見(jiàn)RAS突變(40%～50%)和活化一過(guò)氧化物酶體增殖激活受體γ(PAX8-PPARγ)點(diǎn)突變(35%)及PI3K/A KT突變(6%～13%);胡爾特爾細(xì)胞瘤中存在RAS突變(5%～25%)。低分化和退行性TC中,p53點(diǎn)突變分別為60%～80%、15%～30%;RAS點(diǎn)突變分別為18%～27%、50%～60%;BRAF突變分別為15%、20%。髓樣癌進(jìn)展期常見(jiàn)到RET點(diǎn)突變。大多數(shù)基因改變會(huì)導(dǎo)致促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)系統(tǒng)的激活[8]。

利用基因芯片技術(shù)可對(duì)TC作快速、簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確地分析而得出病變信息:DNA突變發(fā)生在何部位?屬于什么樣的序列突變?基因表達(dá)有何異常?得出正確的診斷后,即可根據(jù)病變的靶序列或靶蛋白設(shè)計(jì)相應(yīng)的藥物,以改變靶序列的表達(dá)情況從而達(dá)到治療疾病的目的,為T(mén)C的早期診斷和分型開(kāi)辟了一個(gè)新的領(lǐng)域口。

2.2 基因芯片的高通量測(cè)序技術(shù) 高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性的改變,1次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定,因此在有些文獻(xiàn)中稱(chēng)其為下一代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing),足見(jiàn)其劃時(shí)代的改變,同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能,所以又被稱(chēng)為深度測(cè)序(deep sequencing)[9]。高通量測(cè)序平臺(tái)的代表是羅氏公司(Roche)的454測(cè)序儀(Roch GS FLX sequencer),Illumina公司的Solexa基因組分析儀(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD測(cè)序儀(ABISOL-iD se-quencer)。2008年4月Helico BioScience公司的Timothy等人,在Science上報(bào)道了他們開(kāi)發(fā)的真正的單分子測(cè)序技術(shù),并利用該技術(shù)對(duì)一個(gè)M 13病毒基因組進(jìn)行重測(cè)序[10]。這項(xiàng)技術(shù)之所以被稱(chēng)為真正的單分子測(cè)序,是因?yàn)樗耆邕^(guò)了上述3種高通量測(cè)序依賴(lài)的基于PCR擴(kuò)增的信號(hào)放大過(guò)程,真正達(dá)到了讀取單個(gè)熒光分子的能力,向1 000美元測(cè)定一個(gè)人類(lèi)基因組的目標(biāo)邁出了一大步。這些平臺(tái)共同的特點(diǎn)是極高的測(cè)序通量,相對(duì)于傳統(tǒng)測(cè)序的96道毛細(xì)管測(cè)序,高通量測(cè)序1次實(shí)驗(yàn)可以讀取40萬(wàn)到400萬(wàn)條序列,讀取長(zhǎng)度根據(jù)平臺(tái)不同從25～450個(gè)堿基,不同的測(cè)序平臺(tái)在1次實(shí)驗(yàn)中,可以讀取1～14G的堿基數(shù)[11],這樣龐大的測(cè)序能力是傳統(tǒng)測(cè)序儀所不能比擬的。

2.3 基因芯片的其他應(yīng)用 由于基因芯片的快速發(fā)展,現(xiàn)已用于社會(huì)各界的各個(gè)領(lǐng)域,如在藥物篩選和新藥開(kāi)發(fā)方面,用芯片作大規(guī)模的篩選研究可以省略大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)甚至臨床,縮短藥物篩選所用時(shí)間,提高效率,降低風(fēng)險(xiǎn)[12];在環(huán)境保護(hù)上,基因芯片也有廣泛的用途,一方面可以快速檢測(cè)污染微生物或有機(jī)化合物對(duì)環(huán)境、人體、動(dòng)植物的污染和危害,同時(shí)也能夠通過(guò)大規(guī)模的篩選尋找保護(hù)基因,制備防治危害的基因工程藥品、或能夠治理污染源的基因產(chǎn)品;基因芯片還可用于司法,現(xiàn)階段可以通過(guò)DNA指紋對(duì)比來(lái)鑒定罪犯,未來(lái)可以建立全國(guó)甚至全世界的DNA指紋庫(kù),到那時(shí)以直接在犯罪現(xiàn)場(chǎng)對(duì)可能是疑犯留下來(lái)的頭發(fā)、唾液、血液、精液等進(jìn)行分析,并立刻與DNA罪犯指紋庫(kù)系統(tǒng)存儲(chǔ)的DNA指紋進(jìn)行比較,以盡快、準(zhǔn)確的破案;基因芯片技術(shù)還可以用來(lái)篩選農(nóng)作物的基因突變,并尋找高產(chǎn)量、抗病蟲(chóng)、抗干旱、抗冷凍的相關(guān)基因,也可以用于基因掃描及基因文庫(kù)作圖、商品檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域。

3 基因芯片有待解決的問(wèn)題及其新進(jìn)展

基因芯片技術(shù)仍然處于發(fā)展階段,要發(fā)展成為實(shí)驗(yàn)室普遍采用的技術(shù)仍有一些關(guān)鍵問(wèn)題亟待解決:(1)相比No rthern blot或RT-PCR,不能檢測(cè)微量m RNA;(2)熒光標(biāo)記不均一,靈敏度低;(3)制作程序復(fù)雜,樣品處理繁瑣,成本高;(4)雜交條件高度個(gè)體化,難以形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。隨著芯片技術(shù)的不斷成熟,很多問(wèn)題正在逐步解決。如DNA合成方法的改進(jìn),現(xiàn)已允許更長(zhǎng)的寡核苷酸探針用于點(diǎn)陣芯片。探針的構(gòu)造變得簡(jiǎn)化,沒(méi)有了PCR的擴(kuò)增,僅要求清洗。這同時(shí)提高了雜交的一致性、批處理的一致性和點(diǎn)陣的一致性[13]。為了使每一個(gè)樣品雜交的費(fèi)用降到最低,現(xiàn)在多采用單染色。因此,越來(lái)越多的cDNA芯片的研究轉(zhuǎn)向于寡核苷酸芯片研究。另一個(gè)改進(jìn)方向是采用8 cm×12 cm的標(biāo)準(zhǔn)微型芯片[14]。通過(guò)機(jī)器人分配液體,96個(gè)樣品從準(zhǔn)備、擴(kuò)增、標(biāo)記、清洗及雜交都可以同時(shí)自動(dòng)處理,即形成縮微芯片實(shí)驗(yàn)室(1ab-on-a-chip)。再進(jìn)一步結(jié)合衛(wèi)星傳輸和網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)的資源,真正實(shí)現(xiàn)高通量、一體化、移動(dòng)性的“未來(lái)型掌卜實(shí)驗(yàn)室”。

此外,基因芯片正結(jié)合以下新技術(shù)向新的方向發(fā)展:(1)激光捕獲顯微切割技術(shù)(laser-capturemicrodissection,LCM)[15],由美國(guó)癌癥研究所發(fā)明,可以得到某一特定細(xì)胞的純?nèi)骸Ｔ摷夹g(shù)是用組織病理學(xué)方法對(duì)冷凍組織染色,用激光在顯微鏡下切割特定區(qū)域的組織,從微型膠片上得到純細(xì)胞群。最近已有將基因芯片技術(shù)和LCM技術(shù)結(jié)合用來(lái)研究頭頸部鱗狀細(xì)胞癌基因表達(dá)譜的報(bào)道。(2)染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)(chromatin immunop recipitation,ChiPs)[16],ChiPs可以鑒別已知蛋白質(zhì)和DNA序列的交互作用,提供靶基因特定轉(zhuǎn)錄因子的信息。該技術(shù)與基因芯片相結(jié)合,可以把已知基因組的DNA序列雜交到芯片上,這等同于把基因的啟動(dòng)子捆綁在蛋白質(zhì)上面。這種相結(jié)合的方法已用于檢測(cè)酵母的轉(zhuǎn)錄控制。(3)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism s,SNPs)分析[17],將來(lái)基因芯片技術(shù)的一個(gè)主要挑戰(zhàn)就是識(shí)別SNPs。現(xiàn)在已經(jīng)通過(guò)特定的SNPs芯片,大規(guī)模地研究SNPs分析。目前,基因芯片已經(jīng)可以識(shí)別1 000個(gè)已知的SNPs,檢測(cè)更大量的SNPs(達(dá)到100 000 SNPs)基因芯片正在研究中。(4)蛋白質(zhì)和抗體芯片,是在EL ISA基礎(chǔ)上采用xMAP(flexible multianalyte p rofiling)技術(shù)發(fā)展起來(lái)的新芯片,又稱(chēng)液相芯片(1iquichip)。與傳統(tǒng)芯片相比,整個(gè)反應(yīng)都在液相中進(jìn)行,不需要洗滌,靈敏度高,被認(rèn)為是質(zhì)譜分析法后又一實(shí)用的分析復(fù)雜蛋白組分的技術(shù),目前已用于細(xì)胞因子、激酶等的檢測(cè)。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2010.22.059

R454.9;R736.1

A 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:1671-8348(2010)22-3128-04

2010-03-15)

重慶市科委自然基金資助項(xiàng)目(2007BB5310)。△

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