副衣原體的生物學特征及分離培養的研究進展

黃新蓉 劉劼

副衣原體的生物學特征及分離培養的研究進展

黃新蓉 劉劼

副衣原體是1997年初從2例女性阿米巴感染者鼻黏膜中分離出來的細胞內共生微生物。現有的證據表明副衣原體是引起人類呼吸道感染的重要病原體。因此，其分離培養對研究其致病機制以及快速診斷具有重要的意義。本文就近年來有關副衣原體的生物學特征、分離培養方法以及快速診斷方面的研究進展作一綜述。

1 副衣原體的分類

除眾所周知的經典衣原體家族外，最新發現的衣原體家族成員有：副衣原體科(parachlamydiaceae)，西門坎氏菌科(Simkaniaceae)和石德菌科(Waddliaceae)。目前研究表明，副衣原體科主要分為棘阿米巴副衣原體(parachlamydia acanthamoeba PA)和哈氏變形蟲新衣原體(Neochlamydia artmanellae NH)兩個屬。副衣原體自然感染阿米巴，與衣原體屬的復制周期相似，16SrRNA的同源性為80%～90%[1]。

2 副衣原體的形態學

副衣原體和其他衣原體一樣，具有獨特的發育周期，即原體(elmentary body EB)和網狀體(reticulate body RB)，其中RB代謝相對活躍，但無感染性[2-3]。Greub G[2]等在共同培養PA菌株UWC1和活性淤泥時，用電鏡觀察到副衣原體UV-7位于UWC1空泡中。其中EB直徑約為0.3～0.5μm，RB輕微增大，直徑約為0.5～0.7μm，不同的菌株原體和網狀體直徑相差比較大。

近年Gilbert等用多食棘阿米巴Linc-AP1與Bn9和Hall，s球菌分別在PYG培養基中共同培養，分別于8、36和144h用電子顯微鏡進行觀察，結果發現有5例多食棘阿米巴滋養體被PA感染，同時在阿米巴內、外均可觀察到新月體，推測其主要功能是延長潛伏期。另外，還可以用SAMBA軟件對新月體進行形態和定量分析，對多食棘阿米巴內副衣原體的生命周期進行量化分析[3]。隨后Greub G[4]等的研究進一步證實PA可能存在第三種發育階段—新月體期，此階段很少被觀察到，可能是副衣原體的這個生長發育階段不具有明顯的特征，新月體在其他衣原體屬中并未發現。

3 副衣原體宿主的選擇

眾所周知自生生活阿米巴(Free-living amoebae FLA)是細菌共生生物[2]，而副衣原體是主要胞內寄生物之一。研究證實副衣原體難以在無細胞的純培養基內生長，從而可證明此類細菌為專性的胞內共生體，副衣原體比較合適的宿主是棘阿米巴，并且極易與棘阿米巴共生，將其作為復制的載體，且具有在不同棘阿米巴中復制增殖的能力[5]。

4 副衣原體菌株感染宿主細胞

1995年Kahane等開拓了在實驗室使用細胞培養污染物的新領域。早期的研究一般不用哺乳動物細胞培養副衣原體，但近來越來越多的實驗證明副衣原體菌株能在多種細胞中存活。第一例報告是Berg17在Vero細胞中成功培養，但目前Bn9和Hall’s菌株在Vero細胞中尚未成功培養[5]。另外，Bn9菌株在McCoy細胞，P388D1巨噬細胞和人類胚胎成纖維細胞也未培養成功。以前認為胞內菌寄生物的宿主范圍受棘阿米巴屬限制，但近來研究表明副衣原體UV-7不受宿主UWE1的限制，可入侵哺乳動物細胞，如Vero，Hela和NCI-H292細胞。通過檢測呼吸道標本16S rRNA基因序列獲得的CorvenA4[6]，將其標本感染Vero和Hela細胞培養尚未有成功的報道。除此之外，副衣原體還可以感染人類肺泡壁細胞(A549)和肺成纖維細胞(HEL)，并在其中進行復制。

5 副衣原體分離培養

目前可以從環境樣本和臨床標本檢測和分離獲得PA。環境樣本主要有土壤、活性淤泥、淡水、海水等。包括人類呼吸道標本、眼角膜組織、腦組織和皮膚病灶、粥樣硬化斑塊和外周血單個核細胞等[7]。

Gilbert[1]等證實目前分離阿米巴中的副衣原主要有兩種方法。一是將臨床標本直接在PAS(Page’s modified Neff’s amoeba saline)中培養，PAS是一種專門用于阿米巴培養的培養基，其特點是培養基中無營養成分，能抑制臨床標本中污染物的過度生長。阿米巴最佳生長溫度為30～35℃，需培養數天或幾周，培養過程中需要定期檢查有無阿米巴分解或Gimenez陽性球菌的出現。另一種方法是將臨床標本接種至無營養瓊脂培養基(100mlPAS培養液中加入1.5g瓊脂)，再覆蓋一層60℃熱滅活1小時的大腸桿菌[8]，于25-30℃培養。

先前的PA的分離培養最大的缺點是費時[2]，近年來比較熱門和實用的方法是采用共同培養的方法獲得環境樣本菌株。Astrid[2]等對工業廢水治理工廠中的活性淤泥(activated sludge)與未感染副衣原體的棘阿米巴標準株UWE1進行共同培養，成功獲得一株新的副衣原體命名為UV-7。經鑒定UV-7的16S rRNA序列與PA的同源性為98.7%。

6 副衣原體分離培養的影響因素

研究證實抗生素、溫度和發病率等對副衣原體的分離培養有影響。Maurin[4]等發現PA對慶大霉素較為敏感，使用此氨基甙類抗生素有可能阻礙副衣原體的俘獲。大環內酯類、四環素類抗生素及磺胺類藥物等也會抑制副衣原體的生長，故不能在培養基中添加上述抗生素。另一方面，棘阿米巴對生長條件的耐受性遠大于其它的阿米巴(如納氏蟲屬阿米巴)，對溫度要求也不嚴格，可在37℃左右很好的存活[7]，但是在培養含有胞內菌的棘阿米巴時，孵育期間的溫度一般在32℃左右，高溫下阿米巴非常容易形成囊胞，而且在大于32℃的時候副衣原體易誘導阿米巴發生溶胞[1]。冷凍可能會造成衣原體的活力喪失，但添加2%～10%胎牛血清可以減少失活率。

再者，雖然大量血清學和分子學研究證據證實副衣原體可引起吸入性肺炎和社區獲得性肺炎，還可引起下呼吸道感染(細支氣管炎和支氣管炎)，但是同時也證實副衣原體DNA在支氣管肺泡灌洗液標本中檢測結果非常罕見(約為0.083%)。

7 結論與展望

目前迫切需要從臨床標本和環境樣本中成功分離培養出PA菌株及發現未知的且同源性較高的新種類。分離培養出PA菌株對進一步證實PA的致病性、致病機制、快速診斷等均具有十分重大的意義。尋找除共同培養方法、PCR檢測16S rRNA基因特異性基因序列以外更好、更快捷的培養及檢測方法。

[1]Greub G,Raoult D.Parachlamydiaceae:potential emerging pathogens.Emerg Infect Dis.2002 Jun,8(6):625-630.

[2]Greub G,Raoult D.Parachlamydiaceae:potential emerging pathogens.Emerg Infect Dis,2002,8(6):625-630.

[3]Corsaro D,Venditti D,Le Faou A,Guglielmetti P,Valassina M.A new chlamydia-like 16S rDNA sequence from a clinical sample.Microbiology,2001,147(Pt 3):515-516.

[4]Maurin,M.,A.Bryskier,and D.Raoult.2002.Antibiotic susceptibilities of Parachlamydia acanthamoebae in amoebae. Antimicrob.Agents Chemother.46:3065-3067.

[5]Greub G,Raoult D.Crescent bodies of Parachlamydia acanthamoeba and its life cycle within Acanthamoeba polyphaga:an electron micrograph study.Appl Environ Microbiol,2002,68(6):3076-3084.

[6]Casson N,Posfay-Barbe KM,Gervaix A,Greub G.New diagnostic real-time PCR for specific detection of Parachlamydia acanthamoebae DNA in clinical samples.J Clin Microbiol,2008,46(4):1491-1493.

[7]Schuster FL.Cultivation of pathogenic and opportunistic freeliving amebas.Clin Microbiol Rev.2002 Jul,15(3):342-354.

[8]Greub G,Desnues B,Raoult D,Mege JL.Lack of microbicidal response in human macrophages infected with Parachlamydia acanthamoebae.Microbes Infect,2005,7(4):714-719.

10.3969/j.issn.1009-4393.2010.14.022

421001 湖南省衡陽市南華大學病原生物學研究所 (黃新蓉 劉)