多重PCR檢測(cè)反復(fù)上呼吸道感染兒童病毒的研究

張英 張荔茗 黃雪梅

多重PCR檢測(cè)反復(fù)上呼吸道感染兒童病毒的研究

張英 張荔茗 黃雪梅

目的 探討多重PCR在檢測(cè)反復(fù)上呼吸道感染兒童中病毒的價(jià)值。方法 獲取急性上呼吸道感染兒童的呼吸道臨床標(biāo)本，設(shè)計(jì)4組病毒套式PCR引物，對(duì)其進(jìn)行基因擴(kuò)增。結(jié)果 在102例急性反復(fù)呼吸道感染兒童中，66例患者至少有1種病原體陽(yáng)性，其中以流感病毒A，副流感病毒，呼吸道合胞病毒最常見(jiàn)，但并未檢測(cè)出冠狀病毒如SARS。結(jié)論 多重PCR能快速檢測(cè)急性呼吸道感染患者中的多種病毒，可用于臨床診斷與疾病監(jiān)測(cè)。

多重PCR；上呼吸道感染；病毒

反復(fù)上呼吸道感染是兒童中最常見(jiàn)的疾病，病毒是最常見(jiàn)的感染因素。自從PCR技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，它已經(jīng)成為了難培養(yǎng)病原體如病毒檢測(cè)的理想方法。但單一的PCR反應(yīng)一次只能檢測(cè)一種病原體，隨后衍生的多重PCR原理與普通PCR一樣，但因在反應(yīng)體系中加入了多對(duì)引物，因此能在同一反應(yīng)試管內(nèi)同時(shí)檢出多種病原體，能為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息[1]。本研究通過(guò)運(yùn)用多重PCR對(duì)102例急性上呼吸道感染兒童標(biāo)本中病毒進(jìn)行了檢測(cè)，研究結(jié)果如下。

1 材料和方法

1.1 病人的選擇 本研究的102例反復(fù)上呼吸道感染的兒童均為2008年4月～2009年12月我市三甲醫(yī)院收治的門診或兒科住院患者，年齡均不超過(guò)12歲。反復(fù)急性上呼吸道感染按1987年成都會(huì)議診斷標(biāo)準(zhǔn)，即0～2歲上感次數(shù)7次/年，5～6歲6次/年，6～12歲5次/年以上；突然發(fā)病(＜36h)，并至少有以下1項(xiàng)癥狀或體征：咳嗽，咽喉疼痛，耳痛，聲音嘶啞，喘鳴/哮鳴音，呼吸困難或伴發(fā)熱。

1.2 多重PCR 無(wú)菌條件下獲取病人鼻咽抽吸物和鼻咽拭子雙份標(biāo)本用于核酸提取。核酸提取試劑盒以及PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，方法按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)共采用4組套式PCR引物用于檢測(cè)17種呼吸道病毒和非典型性細(xì)菌。第1組引物用于擴(kuò)增A、B流感病毒和H1、H3、H5亞型。第2組引物用于擴(kuò)增1、2、3、4型副流感病毒。第3組引物用于A、B型呼吸道合胞病毒，鼻病毒、腸道病毒的檢測(cè)。第4組引物用于擴(kuò)增冠狀病毒OC43，229E，SARS-CoV，以及變性肺病毒。擴(kuò)增條件按照參考文獻(xiàn)提供的方法進(jìn)行[2]。

2 結(jié)果

在本研究當(dāng)中，102例標(biāo)本共檢測(cè)出66例患者至少有1種病原體陽(yáng)性(64.7%，66/102)，其中鼻咽抽吸物中檢測(cè)出32例(31.4%，32/102),雖然略高于鼻咽拭子(29.4%，30/102),經(jīng)x2檢驗(yàn)兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。所有檢測(cè)出的病原體中，以流感病毒A，副流感病毒，呼吸道合胞病毒最常見(jiàn)，占43.9%(39/66)。另外9例患者存在2種病原體感染，包括：2例變性肺病毒合并腺病毒感染，2例患者副流感病毒合并呼吸道合胞病毒感染，其余5例兒童為合并其他細(xì)菌感染。1例患者同時(shí)伴有呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腸道病毒感染。

3 討論

PCR技術(shù)是一種快速、簡(jiǎn)便、特異的核酸分析擴(kuò)增手段，近年來(lái)在臨床上應(yīng)用非常廣泛。由于病毒分離培養(yǎng)難，而常規(guī)的ELISA檢測(cè)往往需要獲得雙份血清標(biāo)本，或者因假陽(yáng)性的問(wèn)題而存在各種不足，特別是對(duì)于罕見(jiàn)、難培養(yǎng)的支原體、衣原體，PCR技術(shù)也許是唯一可行的方法。根據(jù)PCR技術(shù)的檢測(cè)量，可分為普通PCR(或單一PCR)及多重PCR。普通PCR僅應(yīng)用一對(duì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)核酸片段，主要用于單一病原體的鑒定[3]。但在臨床上，如急性反復(fù)上呼吸道感染，通常是由多種病原菌引起的混合感染，因此建立快速、精確的檢測(cè)方法，對(duì)臨床指導(dǎo)用藥具有極其重要的意義。

在本研究當(dāng)中，共檢測(cè)出66例病毒陽(yáng)性標(biāo)本，檢出率達(dá)64.7%?？赡苁潜狙芯慨?dāng)中病例選取的差異等原因，鼻咽抽吸的陽(yáng)性檢出率略高于鼻咽拭子，而統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明兩種不同的取材方法對(duì)檢出率無(wú)明顯差別[4]。從檢測(cè)出的病原體來(lái)看，以流感病毒A，副流感病毒，呼吸道合胞病毒最常見(jiàn)，同時(shí)，2種以上病毒感染也非常常見(jiàn)，包括變性肺病毒合并腺病毒感染、副流感病毒合并呼吸道合胞病毒感染以及并發(fā)其他細(xì)菌感染。

多重PCR的另一優(yōu)勢(shì)是大大縮短了病原體的檢測(cè)時(shí)間。通常情況下，普通PCR需要花費(fèi)35min～3h，而多重PCR能在1d內(nèi)同時(shí)完成近20種病原體的檢測(cè)。因此從某種意義上講，盡快做出病原學(xué)診斷，不但對(duì)早期給予相應(yīng)的治療提供了參考，減少誤診，同時(shí)也能減輕患者及家屬的焦慮情緒。但任何事物都具有兩面性，多重PCR雖然優(yōu)勢(shì)明顯，但因涉及到多條引物，如果設(shè)計(jì)不合理，在反應(yīng)過(guò)程可能會(huì)降低反應(yīng)的敏感性，且費(fèi)用較普通PCR高[6]，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求比較苛刻。

當(dāng)然，單純憑PCR結(jié)果陽(yáng)性尚不能作出某病原體感染的結(jié)論，還需要結(jié)合其他診斷方法及臨床資料。盡管如此，多重PCR因其快速、高通量檢測(cè)，這在流行病學(xué)分析以及疾病監(jiān)測(cè)方面，依然具有重要意義。

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[3]Gallei A,Pesch S,Esking WS,et al.Porcine Torque teno virus:determination of viral genomic loads by genogroup-specific multiplex rt-PCR,detection of frequent multiple infections with genogroups 1 or 2,and establishment of viral full-length sequences[J].Vet Microbiol.2010,143(2-4):202-212.

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10.3969/j.issn.1009-4393.2010.21.108

418000 懷化醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 (張英 張荔茗 黃雪梅)