杯狀病毒受體研究進展*

陳 柳,劉光清,宋 毅,3,倪 征,余 斌,華炯鋼,李雙茂,云 濤*

(1.浙江省農業科學院農業部病毒學與生物技術重點實驗室,浙江杭州310021;2.中國農業科學院上海獸醫研究所,上海200241;3.浙江師范大學化學與生命科學學院,浙江金華321004)

杯狀病毒(Caliciviruses)呈球形或近球形,直徑30 nm～35 nm,無囊膜,核衣殼呈二十面體對稱。杯狀病毒科病毒包括4個屬,分別為兔病毒屬(Lagovirus),代表種為兔病毒性出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV);諾瓦病毒屬(Norovirus),代表種為諾瓦克病毒(Norwalk virus,NoV);扎幌病毒屬(Sappovirus),代表種為扎幌病毒(Sapporovirus)及水皰疹病毒屬(Vesivirus),以豬水皰疹病毒(Vesicular exanthema of swine virus,VESV)為代表種。杯狀病毒的基因組結構很相似,基因組長約7.4 kb～7.7 kb,含有2個～4個開放閱讀框(open reading frame,ORF),其中,Ⅱ和Ⅲ型扎幌病毒和RHDV含有2個ORF(ORF1、ORF2),Ⅰ型、Ⅳ型和Ⅴ型扎幌病毒、諾瓦克病毒和貓杯狀病毒含有3個ORF(ORF1、ORF2、ORF3),在南安普頓病毒(Southampton virus,SV)基因組中還發現了ORF4,位于ORF2和ORF3之間。雖然ORFs組成不同,但編碼出的結構蛋白都僅有衣殼蛋白和次結構蛋白兩種。除了全長基因組以外,在杯狀病毒顆粒中還有許多豐富的亞基因組mRNA分子,其大小約2.2 kb～2.4 kb。亞基因組中含有衣殼蛋白的編碼序列,可以翻譯出具有自聚合能力的衣殼蛋白。不同杯狀病毒的衣殼蛋白具有較高的氨基酸序列同源性,尤其在氨基端和羧基端,且在衣殼蛋白中都含有一個大約250個氨基酸的保守序列,該區域在病毒的復制或病毒顆粒裝配中發揮重要作用[1]。杯狀病毒衣殼蛋白不僅在病毒裝配、病毒免疫、而且在病毒識別、侵入宿主過程中起著重要的作用。

杯狀病毒科病毒具有較廣的宿主范圍,能引起多種動物和人類疾病。侵入宿主細胞是病毒進行感染的首要環節,杯狀病毒首先需要與受體結合,之后通過細胞內吞作用進入細胞。由于該科病毒除水皰疹病毒屬的VESV、貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)和圣米吉爾海獅病毒(San Miguel sea-lion virus,SMSV)外,沒有很好的體外培養體系,制約了對該科病毒的研究。關于杯狀病毒受體的研究,目前只在少數幾個種屬中取得了一定進展。

1 碳水化合物受體

1.1 組織血型抗原

杯狀病毒科的很多病毒能夠識別宿主細胞和組織的血型抗原,包括A、B、H和Lewis型組織血型抗原(HBGAs)。RHDV能識別成年兔體上呼吸道及消化道上皮細胞表面的HBGAs-H2,病毒識別并結合HBGAs從而啟動病毒對機體的入侵,而L-巖藻糖是RHDV病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)識別HBGAs的最基本結構[2-3]。杯狀病毒中與HBGAs結合研究的比較透徹的是人諾瓦克病毒,曾玫等寫了較為詳盡的綜述[4]。Marionneau S等[5]首次報道重組諾瓦克病毒樣顆粒(rNoVVLPs)可識別Se+人體胃十二指腸上皮細胞的H1和H3/4抗原,Huang P等[6]研究了不同諾瓦克病毒毒株衣殼蛋白與人唾液HBGAs的結合情況,發現不同毒株識別不同的HBGAs,目前至少發現了4種結合模式,其中3種模式的NoVs(VA387、NV和MOH)識別分泌型血型組織抗原,而另一種NoV(VA207)識別Lewis陽性的非分泌型。Tan M等[7]通過多序列比對、同源模擬、及對NoV衣殼蛋白進行結構分析,初步確定P2區袋狀樣結構與HBGAs結合有關,結合袋底部包含一個保守的RGD/K樣motif和3個環繞四周的特異氨基酸位點,且不同毒株的這些位點不同(VA387株為N302、T337、Q375;MOH株為N302、N338、E378),定點突變試驗進一步證實以上4個位點對病毒與受體結合有重要作用。Tan M等[8]又進一步用3種不同結合模式的NoVs病毒株(NV、VA387和MOH)證實完整的P區對于病毒與HBGAs特異性結合是必要的,研究發現P區獨立表達時雖不能形成VLPs,但可形成二聚體,其與HBGAs結合模式和完整病毒衣殼相同;相反,S區能形成小的薄層VLPs,但不與A、B或H HBGAs結合。Tan M等[9]進一步研究了P區構象對受體親和性的影響,發現P區鉸鏈結構的存在與否起著至關重要的作用,如果VA387 P區含鉸鏈結構時主要形成二聚體,與HBGAs親和性較低,一旦P區鉸鏈結構去除形成T=1的二十面體P粒子,其受體親和力較P二聚體增強至少700倍,可與VLP相比。

1.2 唾液酸

對于杯狀病毒細胞受體的研究,主要集中于能在體外進行高滴度培養的FCV。Kreutz L C等[10]發現FCV對氯奎比較敏感,提示酸化環境是病毒感染細胞所必需的。之后,Stuart A D等[11]進一步證實,FCV經內涵素介導的細胞內吞作用感染細胞,且細胞質內的酸化環境有利于病毒基因組脫殼后進入細胞質。又有研究發現用蛋白酶處理Crandell-Reese貓腎細胞系(crandell-reese feline kidney,CRFK)能夠增加FCV與之結合,而磷酸酯酶對FCV與細胞結合沒有任何影響。相反,預先用神經氨酸苷酶處理,之后用O-寡糖酶處理的細胞與病毒結合能力大大減弱。這些研究表明,FCV的細胞受體含有功能重要的碳水化合物組分[12]。Stuart A D等[13]通過化學試劑和酶處理對宿主細胞表面某些成分進行阻斷,發現FCV能夠識別細胞表面一種N-連接糖基化蛋白的α2,6-唾液酸糖基成分。近幾年來,發現鼠諾瓦克病毒(Murine norovirus-1,MNV-1)能夠很好地在鼠巨噬細胞及樹狀突細胞中增殖,基于該病毒體外培養模型,Taube S等[14]對MNV-1的細胞受體進行了初步探討,研究發現,用唾液酸結合物凝集素以及神經氨酸酶處理能減少Ⅰ型鼠諾瓦克病毒(MNV-1)對鼠巨噬細胞的感染,說明唾液酸在MNV-1的吸附與感染宿主中起著重要的作用。因為唾液酸能吸附神經節苷脂等糖脂,作者進一步探討了鼠巨噬細胞表面存在的3種神經節苷脂(GD1a,GM1和唾液酸基缺乏的GM1(GA1))在MNV-1感染巨噬細胞中的作用,結果表明,MNV-1只能結合GD1a而不與另外兩種神經節苷脂結合,用葡糖基神經酰胺酶合成酶抑制劑(D-thero-P4)處理巨噬細胞,發現MNV-1對處理之后的細胞的感染能力下降,而向培養的該細胞中加入GD1a能恢復MNV-1對該巨噬細胞的感染。這些現象對其它的兩株病毒株也同樣適用。以上研究說明MNV能用巨噬細胞表面位于神經節苷脂末端的唾液酸作為細胞受體。

1.3 硫酸乙酰肝素

Tamura M以桿狀病毒表達系統表達獲得的NoV病毒樣顆粒VLPs為材料,對NoV VLPs與細胞表面硫酸乙酰肝素的結合特性進行了研究,發現肝素和蘇拉明(一種高度硫酸化的尿素衍生物)能有效地阻斷VLPs與哺乳細胞表面的結合,且一些已知的能與細胞表面硫酸乙酰肝素結合的試劑和能降解硫酸乙酰肝素的酶類能大大降低VLPs與細胞的結合,進一步用馬來酸氯苯那敏片處理細胞發現硫酸乙酰肝素的硫酸化修飾對其與VLPs結合起關鍵作用[15]。

2 細胞蛋白受體

除了能以唾液酸作為細胞受體之外,近年來幾個工作組又鑒定出了FCV其他的功能性受體并對其進行了深入的研究,Makino A等[16]從CRFK細胞的cDNA文庫中調出了能與FCV F4毒株結合的細胞黏附蛋白JAM-A,抗JAM-A抗體能夠阻斷FCV感染CRFK細胞,同時貓JAM-A(feline JAMA,fJAM-A)分子在FCV非敏感倉鼠肺細胞中的表達能使FCV F4毒株及其他幾株測試株感染該細胞,說明fJAM-A是FCV的一種功能性受體分子。對fJAM-A分子的不同區域與FCV的結合能力進行分析發現,僅Ig樣的細胞外區域D1在與FCV結合過程中是必需的,其他的區域皆能被替代,但用FCV進行細胞感染時,除D1區域外,fJAM-A分子的其他區域也是病毒感染必不可少的。同時,fJAM-A表達于細胞表面并不滿足所有該研究所用FCV分離株對細胞的易感性,由此,作者推測fJAM-A蛋白是FCV的輔助受體,除fJAM-A之外,還需要其他因子參與FCV的感染,同時對于不同的分離株,需要不同的因子參與[17]。Bhella D等[18]對FCV衣殼蛋白VP1與fJAM-A分子結合的部位進行了探討,發現VP1的P2結構域的外表面(含有高可變區及中和抗原表位)參與VP1與fJAM-A的結合,之后,VP1蛋白構象發生改變,啟動病毒脫衣殼。由此可見,對于FCV的細胞受體主要集中于兩點,一是細胞表面的碳水化合物,二是細胞表面蛋白,FCV侵入宿主細胞是一個多方位的過程,需要多種因素參與。關于NoV細胞蛋白受體的研究,也有零星的報道。T amura M等[19]通過病毒輔覆蛋白印跡技術(virus overlay protein blot assay,VOPBA)發現一個存在于多種哺乳動物細胞系細胞膜上的分子質量為105 ku的膜蛋白能與諾瓦克病毒樣顆粒直接相互作用,這種結合不依賴膜蛋白的天然構象,推測該蛋白是病毒的細胞受體,但該蛋白為何種物質尚未得到鑒定。2003年又報道可溶性的組蛋白分子能夠阻斷諾瓦克病毒感染哺乳動物細胞,H1組蛋白不僅能與諾瓦克病毒粒子結合,而且能結合于宿主細胞[20],該研究結果不僅給病毒受體研究提供了借鑒,而且為抗病毒藥物的研發提供了思路。

3 結語

病毒受體的研究一直是病毒學科的熱點和難點,而研究方法的選用恰當與否決定了病毒受體的研究進程。除了一些通用的方法如文庫篩選、噬菌體表面展示技術、VOPBA、免疫共沉淀技術、克隆表達技術及病毒受體阻斷劑的應用等等,針對杯狀病毒科病毒的特點還可選用如下幾種替代方法:①由于該科病毒大部分缺乏體外培養體系,因此可以采用假病毒體系來替代野生病毒進行受體研究;②杯狀病毒衣殼蛋白能自聚合形成VLPs,也可通過表達獲得自聚合形成VLPs的衣殼蛋白來代替野生病毒進行受體研究;③病毒受體大多為膜蛋白,常規的酵母雙雜交發生于細胞核中,不適合病毒受體的篩選,可以用Split-ubiquitin膜蛋白酵母雙雜交系統替代[21-24]。

病毒感染宿主的基本前提是它首先要與宿主細胞表面的受體結合,這種結合不僅決定病毒的致病性,也決定病毒的宿主嗜性范圍。杯狀病毒細胞受體的闡明將有助于揭示病毒的感染途徑及其致病的分子機制,對于深刻理解病毒與宿主細胞的相互關系以及有針對性地研制有效的抗病毒藥物、疫苗具有重大的理論與實踐意義。更進一步,如果能找到病毒黏附蛋白與病毒受體的結合位點,就可以從封閉病毒的受體結合位點和封閉受體兩方面來阻斷病毒與受體的結合。

[1] 劉光清,陳鴻軍,陳 柳,等.動物病毒反向遺傳學[M].北京:科學出版社,2009:128-140.

[2] Ruvon-Clouet N,Ganire J P,Andr-Fontaine G,et al.Binding of rabbit haemorrhagic disease virus to antigens of the ABH blood group family[J].J Virol,2000,74(24):11950-11954.

[3] Rademacher C,Krishna N R,Palcic M,et al.NM R experiments reveal the molecular basis of receptor recognition by a calicivirus[J].J Am Chem Soc,2008,130(11):3669-3675.

[4] 曾 玫,王曉紅,朱啟镕.諾如病毒及其受體人類組織血型抗原的研究進展[J].臨床兒科雜志,2007,25(12):1036-1039.

[5] Marionneau S,Ruvoen N,Le Moullac-Vaidye B,et al.Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals[J].Gastroenterology,2002,122(7):1967-1977.

[6] Huang P,Farkas T,Marionneau S,et al.Noroviruses bind to human ABO,Lewis,and secretor histo-blood group antigens:identification of 4 distinct strain-specific patterns[J].J Infect Dis,2003,188(1):19-31.

[7] Tan M,Huang P,Meller J,et al.Mutations within the P2 domain of norovirus capsid affect binding to human histo-blood group antigens:evidence for a binding pocket[J].J Virol,2003,77(23):12562-12571.

[8] Tan M,Hegde R S,Jiang X.The P domain of norovirus capsid protein forms dimer and binds to histo-blood group antigen receptors[J].J Virol,2004,78(12):6233-6242.

[9] Tan M,Jiang X.The p domain of norovirus capsid protein forms a subviral particle that binds to histo-blood group antigen receptors[J].J Virol,2005,79(22):14017-14030.

[10] K reutz L C,Seal B S.The pathway of feline calicivirus entry[J].Virus Res,1995,35:63-70.

[11] Stuart A D,Brown T D K.Entry of feline calicivirus is dependent on clathrin-mediated endocytosis and acidification in endosomes[J].J Virol,2006,80(15):7500-7509.

[12] K reutz L C,Seal B S,Mengeling W L.Early interaction of feline calicivirus with cells in culture[J].Arch Virol,1994,136(1-2):19-34.

[13] Stuart A D,Brown T D.α 2,6-linked sialic acid acts as a receptor for feline calicivirus[J].J Gen Virol,2007,88:177-186.

[14] Taube S,Perry J W,Yetming K,et al.Ganglioside-linked terminal sialic acid moieties on murine macrophages function as attachment receptors for murine noroviruses[J].J Virol,2009,83(9):4092-4101.

[15] Tamura M,Natori K,Kobayashi M,et al.GenogroupⅡnoroviruses efficiently bind to heparan sulfate proteoglycan associated with the cellular membrane[J].J Virol,2004,78(8):3817-3826.

[16] M akino A,Shimojima M,Miyazawa T,et al.Junctional adhesion molecule 1 is a functional receptor for feline calicivirus[J].J Virol,2006,80:4482-4490.

[17] Ossiboff R J,Parker J S L.Identification of regions and residues in feline junctional adhesion molecule required for feline calicivirus binding and infection[J].J Virol,2007,81(24):13608-13621.

[18] Bhella D,Gatherer D,Chaudhry Y,et al.Structural insights into calicivirus attachment and uncoating[J].J Virol,2008,82(16):8051-8058.

[19] Tamura M,NatorI K,Kobayashi M,et al.Interaction of recombinant norwalk virus particles with the 105-kilodalton cellular binding protein,a candidate receptor molecule for virus attachment[J].J Virol,2000,74(24):11589-11597.

[20] Tamura M,Natori K,Kobayashi M,et al.Inhibition of attachment of virions of Norwalk virus to mammalian cells by soluble histone molecules[J].A rch Virol,2003,148(9):1659-1670.

[21] T haminy S,Miller J,Stagljar I.The split-ubiquitin membrane-based y east two-hybrid system[J].Methods Mol Biol,2004,261:297-312.

[22] 曹 煒.Split-ubiquitin膜蛋白酵母雙雜交系統的構建及其應用[D].上海:復旦大學生命科學學院,2007:1-95.

[23] Dirnberger D,Messerschmid M and Baumeister R.An optimized split-ubiquitin cDNA-library screening system to identify novel interactors of the human Frizzled1 receptor[J].Nucleic Acids Res,2008,36(6):e37.

[24] Kittanakom S,Chuk M,Wong V,et al.Analysis of membrane protein complexes using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid(MYTH)system[J].Methods Mol Biol,2009,548:247-271.