紫外分光光度法測定硫酸卡那霉素注射液含量方法的建立*

馮學忠,吳廣輝,方炳虎,梁德永,黃麗梅

(1.廣東大華農動物保健品股份有限公司,廣東新興527400;2.華南農業大學獸醫學院,廣東廣州510642)

硫酸卡那霉素為氨基糖苷類抗生素[1],對大多數革蘭陰性桿菌如大腸埃希菌、變形桿菌、沙門菌、多殺性巴氏桿菌等有強大抗菌作用,金黃色葡萄球菌和結核桿菌也對其敏感[2]。內服可用于治療敏感菌所致的腸道感染;肌肉注射用于敏感菌所致的各種嚴重感染,如敗血癥、泌尿生殖道感染、呼吸道感染、皮膚和軟組織感染等[3]。生產中可用于緩解豬喘氣病癥狀[4]。硫酸卡那霉素注射液的含量測定在《中國獸藥典》2005年版一部中采用抗生素微生物檢定法[5],由于該法測定費時,不適于作為生產過程中中間產品的質量控制方法。本文采用紫外分光光度法[6]測定硫酸卡那霉素注射液中卡那霉素的含量[7-13],經與抗生素微生物檢定法比較,結果基本一致。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 UV-2450型紫外可見分光光度計,日本島津產品;CP225D型電子天平,德國賽多利斯有限公司產品。

1.1.2 藥品 硫酸卡那霉素標準品,批號為K0080807(效價:每1 mg相當于694卡那霉素單位)購自中國獸醫藥品監察所;硫酸卡那霉素注射液,規格為10 mL∶1.0 g(100萬單位),批號為20091001,20091002,20091003,廣東大華農動物保健品股份有限公司產品;硫酸為分析純;水為純化水。

1.2 方法

1.2.1 卡那霉素檢測波長的確定 精密稱取硫酸卡那霉素標準品27.0 mg,置于50 mL容量瓶中,加水溶解,并稀釋至刻度,搖勻;精密量取2 mL,置于50 mL容量瓶中,加硫酸10 mL,水浴30 min,冷卻,加水離刻度約1 cm,放冷,再加水至刻度,搖勻。用水作為參比液,按照紫外分光光度法,在190 nm～500 nm波長范圍內進行圖譜掃描。

1.2.2 水解條件的選擇 取1.2.1項下配制的溶液2 mL數份,置于50 mL容量瓶中,各加硫酸5 mL、10 mL,分別水浴10、20、30、40、50 min,然后按1.2.1項下操作,測定其吸收度。

1.2.3 繪制標準曲線 精密稱取硫酸卡那霉素標準品9.0、18.0、27.0、36.0、45.0 mg,分別置于50 mL容量瓶中,加水使之溶解,并稀釋至刻度,搖勻,按1.2.1項下方法稀釋成5、10、15、20、25 U/mL標準溶液,以水為參比液,參照紫外分光光度法,在279 nm波長處測定其吸光度。

1.2.4 穩定性試驗 精密量取硫酸卡那霉素注射液(批號:20091001)3 mL,置200 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻;精密量取25 mL,置于100 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻;再按1.2.1項下方法稀釋至刻度,搖勻,室溫避光,靜置0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h,以水為參比液,按照紫外分光光度法,在279 nm波長處測定吸光度。

1.2.5 空白試驗 按處方比例稱取輔料適量,制備不含硫酸卡那霉素的空白樣品,按1.2.4項下方法稀釋并測定吸光度。

1.2.6 回收試驗 精密稱取卡那霉素對照品18.0、27.0、36.0 mg各3份,分別置50 mL容量瓶中,按處方量加入其他輔料,加溶劑溶解,搖勻,制成小樣,分別精密量取2 mL,置50 mL容量瓶中,按1.2.1項下方法稀釋至刻度,搖勻,并測定其吸光度。

1.2.7 精密度試驗 精密量取硫酸卡那霉素注射液(批號:20091001)3 mL,按1.2.4項下方法稀釋至刻度,搖勻;作為測定硫酸卡那霉素注射液精密度試驗用溶液,并測定吸光度,重復測定5次,進行精密度測定。

1.2.8 紫外分光光度法與抗生素微生物檢定法測定硫酸卡那霉素注射液含量比較

1.2.8.1 紫外分光光度法 取批號為20091001、20091002、20091003的硫酸卡那霉素注射液,精密量取3 mL,分別置于200 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻;精密量取25 mL,置于100 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻;再精密量取2 mL,置50 mL容量瓶中,加硫酸10 mL水浴30 min,冷卻,加水離刻度約1 cm,放冷,再加水至刻度,搖勻,按照紫外分光光度法測定;另取硫酸卡那霉素對照品適量,同法測定,并記錄結果;計算出含量。

1.2.8.2 抗生素微生物檢定法 取批號20091001,20091002,20091003的硫酸卡那霉素注射液,精密量取本品適量,分別用滅菌水定量制成每1 mL中約含1 000單位的溶液,照抗生素微生物檢定法測定。1 000卡那霉素單位相當于1 mg的卡那霉素。記錄結果,計算出含量。

2 結果

2.1 卡那霉素的檢測波長

結果如圖1所示。樣品在波長279 nm±1 nm處有最大吸收。因此,選擇279 nm為檢測波長。

圖1 卡那霉素紫外吸收圖譜Fig.1 The UV map of kanamycin

2.2 水解條件的確定

結果表明,加硫酸10 mL,水浴30 min,卡那霉素與硫酸反應基本穩定,故選擇加硫酸量10 mL,水浴30 min為水解條件。

2.3 標準曲線的繪制

標準曲線制作結果如表1所示。以吸光度(A)為縱坐標,濃度(C)為橫坐標進行線性回歸,得到標準曲線方程:A=0.037 3 C+0.003 2(R=0.999 6,n=5,C的單位為U/mL)。結果表明,在5 U/mL～25 U/mL的濃度范圍內,濃度與吸光度呈良好的線性關系(圖2)。

表1 標準溶液的吸光度Table 1 The absorbency of standard solution

圖2 卡那霉素標準曲線Fig.2 The standard curve of kanamy cin

2.4 穩定性試驗

由表2可見,硫酸卡那霉素注射液在2.5 h內吸光度值基本保持不變,穩定性良好。

表2 硫酸卡那霉素注射液的穩定性試驗Table 2 The stability test of kanamycin sulfate injection

2.5 空白試驗

結果顯示,不含卡那霉素的空白樣品無吸收,即輔料對測定結果無干擾,符合要求。

2.6 回收率試驗

按下式計算含量,并求出回收率,平均回收率為100.3%,RSD為1.8%,結果如表3所示。

式中:A為測得的吸光度值;N為稀釋倍數;V為量取樣品的體積(mL);P為樣品規格10 mL∶1.0 g(100萬單位);0.0032為標準曲線的截距;26.81為標準曲線斜率的倒數。結果表明,硫酸卡那霉素注射液回收率試驗符合要求。

2.7 精密度試驗

硫酸卡那霉素注射液含量的RSD為0.1%,結果如表4所示。結果表明,本法具有良好的精密度。

表3 硫酸卡那霉素注射液回收率試驗Table 3 The recovery rate of kanamy cin sulfate injection

表4 精密度試驗Table 4 P recision test of kanamycin sulfate injection

2.8 紫外分光光度法與抗生素微生物檢定法測定硫酸卡那霉素注射液含量的比較

結果如表5所示。表明紫外分光光度法與抗生素微生物檢定法測得的含量結果基本一致。

表5 硫酸卡那霉素注射液中卡那霉素的含量測定Table 5 Determination of kanamycin content in injection

3 討論

本研究表明,用紫外分光光度法和抗生素微生物檢定法分別測定硫酸卡那霉素注射液中卡那霉素的含量,結果基本一致,說明紫外分光光度法可行。卡那霉素的常用測定方法有抗生素微生物檢定法、旋光法[14]、高效液相色譜(HPLC)法[15-16]等。抗生素微生物檢定法雖然準確,但環境條件要求高,測定周期長,操作復雜,無法達到快速的要求,而且難以區分卡那霉素和其他抗生素藥物;旋光法則分辨能力及重現性較差,準確性較低;高效液相色譜法雖然準確,但成本昂貴,操作繁瑣,而紫外分光光度法所用儀器較普遍,操作簡便、快速,重現性和穩定性良好,結果準確,而且本方法使用的試劑量少,化學反應過程簡單,具有一定的優越性。因此,建議獸藥生產企業采用紫外分光光度法作為生產硫酸卡那霉素注射液過程中中間產品的質量控制方法。

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