小隴山不同林地土壤微生物多樣性研究

張宗舟,張 揚,陳志梅

（1.天水師范學院生命科學與化學學院,甘肅 天水 741001；2.蘭州交通大學化學與生物工程學院,甘肅蘭州 730070）

小隴山林區位于甘肅省東南部,屬長江、黃河上中游地區,是兼有我國南北氣候特點的典型天然次生林區,林地總面積83萬hm2,活立木總蓄積2.92×107m3,森林覆蓋率57.8%。加強小隴山林區森林資源的培育和管護,充分發揮森林資源的生態、經濟和社會功能,對于建設長江、黃河上中游地區生態屏障具有深遠的意義,對當地和長江、黃河中下游地區的經濟、社會發展及人民生命財產安全起到非常重要的作用,土壤微生物積極參與土壤物質轉化過程,其在土壤形成、肥力演變、植物養分有效化、土壤結構的形成與改良、有毒物質降解及凈化等方面起著重要作用[1-3]。19世紀中葉,根瘤菌的分離鑒定標志著人類開始關注土壤微生物及其功能。至20世紀初葉,土壤微生物已經發展成為一門獨立學科[4-6]。土壤微生物作為穩定生態系統,監測土壤品質變化的敏感指標,其多樣性研究在評價生態系統、維護生態平衡中發揮了重要作用,因此越來越多的學者將目光投向土壤微生物多樣性的研究和保護[7-11]。日本落葉松（Larix kaempferi）自1973年引入小隴山林區以來,由于早期速生,成林快,適應性廣,已成為小隴山林業實驗局營造速生豐產林和天保工程公益林營造的主要樹種之一,并且在周邊地區得到了大面積的推廣和應用[12]。目前林地對土壤微生物特征的影響有一些研究,但由于地域差異,不同林地種類和數量、組成不同,造成研究結果存在一定差別,其中同一林區不同林地種類對土壤微生物多樣性的研究更少[13-14]。本研究以甘肅小隴山林區日本落葉松林、華山松（Pinus armandi）林和混交林（華山松和落葉松混種）為對象來分析其土壤中的微生物多樣性,為科學有效地進行人工林的營造及大面積推廣、土壤的恢復與保育以及林地的發展提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 樣點概況及土樣采集小隴山林區（33°31′～34°41′N,104°23′～ 106°43′E）位于秦嶺的西部,海拔700～2 500 m,相對高差500～1 100 m,該區處于我國暖溫帶南緣與北亞熱帶的過渡地帶,氣候溫暖濕潤,大多數地域屬于暖溫帶-中溫帶半濕潤大陸性季風氣候類型,年平均氣溫7.1℃,極端最高氣溫39.2℃,極端最低氣溫-23.2℃；≥10℃積溫2 444～3 825℃·d；年降水量460～800 mm,降水集中分布于7～9月,一般春秋季降水占年降水量的70%～80%,降水的年際變化較大,枯、豐年降水量相差近一倍,年蒸發量989～1 658 mm,相對濕度68%～78%,年日照時數1 520～2 313 h,無霜期 120～218 d[15]。

土壤分布上,秦嶺以北為灰褐土,以南為黃褐土；其垂直分布比較明顯,北坡由低到高依次為碳酸鹽灰褐土、山地褐色土、山地淋溶褐色土、山地棕壤、山地暗棕壤、山地草甸棕壤、山地草甸土和亞高山草甸草原土。南坡由低到高依次為黃褐土、黃棕壤、山地棕壤和暗棕壤,土層厚30～60 cm,較濕潤,有機質含量高,全氮、全鉀含量比較高,全磷含量相對較低,速效磷含量屬于中等水平[16],pH 值6.5～7.5,土壤質地多屬壤土、輕壤土。研究區域有苔蘚、蕨類、裸子和被子植物224科945屬2 700多種。其中草本植物1 900多種,木本植物800多種（不包括引種栽培）,溫帶科屬占優勢,熱帶、亞熱帶屬種比較少。木本植物以殼斗科、樺木科、松科、楊柳科、榆科、槭科、薔薇科和椴科等為主,構成植被的主要組成成分。草本植物158科726屬,以禾本科、菊科、豆科、毛莨科、蘭科、唇形科和玄參科為主。

其自然植被兼有秦嶺南北區特點,屬溫帶暖溫帶落葉闊葉混交次生林,以櫟類及其他硬、軟闊葉樹種為主,有少量的落葉松（L.gmelinii）、馬尾松（P.massoniana）、油松（P.tabulaeformis）、云杉（Picea asperata）、白皮松（P.bungeana）等針葉樹種。林區的日本落葉松面積約1.87萬hm2[17]。

各土樣在采前首先用滅菌工具除去土壤表面的枯葉,鏟除表面1 cm左右的表土,以避免地面微生物與土樣混雜。然后采集 0～10 cm的土壤,每個取土區域在 3個點取土,并于預先準備好的塑料布上,剔除作物殘根,充分混合均勻后取適量土壤裝于無菌自封袋,帶回實驗室分析。

1.2 土壤微生物培養微生物采用稀釋平板培養法進行培養[18-19]。稀釋分離法為:稱取10 g土樣,加入盛有100 mL無菌水的250 mL三角燒瓶中,加入磁珠 3粒,在磁力攪拌器上震蕩10 min后,沉淀10 min,用無菌吸管吸取1 mL土壤懸浮液,注入到9 mL無菌水的試管中,制成10-2的土壤懸液,然后按 10倍法依次稀釋至 10-9。根據以下公式計算每克干土中的微生物數量:

霉菌用查氏（Czapek）培養基:葡萄糖30 g,NaNO32 g,K2HPO4·3H2O 1 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂20 g,自來水1 000 mL,自然pH；放線菌用高氏1號培養基:可溶性淀粉20 g,KNO31 g,NaCl 0.5 g,K2HPO4·3H2O 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂 20 g,自來水1 000 mL,pH值7.4～7.6；細菌用牛肉膏蛋白胨培養基:牛肉膏3 g,蛋白胨 10 g,NaCl 5 g,瓊脂20 g,自來水1 000 mL,pH 值7.2～7.4；自生固氮菌用阿須貝（Ashby）培養基:甘露醇 10 g,KH2PO40.2 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,NaCl 0.2 g,CaSO4·2H2O 0.1 g,CaCO35 g,自來水1 000 mL,瓊脂20 g,pH 值7.2～7.4。纖維素分解菌用無糖培養基:NH4NO35 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,FeCl30.1 g,KH2PO45 g,自來水 1 000 mL,瓊脂20 g,自然pH值,滅菌后倒成平板,待凝固后,每皿在無菌條件下,放置一張中性濾紙；酵母菌用麥芽汁培養基:將干麥芽壓碎（不能太粗或太細,粗則影響糖化,細則阻礙過濾）[20-21]。取1份麥芽屑加4份水浸泡1 h,然后置于63℃水浴鍋中糖化6～12 h,用碘液滴檢至呈黃色至無色時表示糖化已完成,然后用4層紗布過濾。因濾液不澄清,用一雞蛋清充分打勻后倒入糖化液中,加熱攪拌至沸,過濾后即成為透明的麥芽汁,分裝后在121℃下滅菌20 min,備用。將制備的麥芽汁稀釋到5°～6°Be,pH 值 6.4。在其中加入 2.0%瓊脂后,經滅菌即成為麥芽汁瓊脂培養基。青霉菌屬、曲霉屬、交鏈孢屬、芽孢桿菌等均按照魏景超[22]、周與良和邢來君[23]方法進行鑒定和分類。

1.3 土壤微生物多樣性指數測定物種多樣性的研究方法和測定指數比較多,試驗根據土壤細菌、真菌、放線菌和各測定指數的特點及取樣數據的類型,選擇 Shannon-Wiener指數（H′）和Simpson指數（D）[24]:

式中,Pi是第i屬的多度比例,采用Pi=Ni/N計算；Ni是第i屬的菌株數；N=∑Ni,為全部屬的菌株數之和。H′和D2種多樣性指數在動植物群落研究中通常以種為測度單位,但在土壤微生物研究中,由于分離鑒定至種十分困難,因此把細菌、霉菌、放線菌、酵母菌以微生物群為研究單位套用 Shannon-Wiener指數和Simpson指數,來研究土壤微生物的多樣性。用這樣的方法來預測土壤微生物多樣性是可行的[25-26]。

1.4 試驗方法每皿接種0.1 mL土壤稀釋液,涂布,倒置培養。細菌、放線菌28℃培養5 d,真菌25℃培養7 d,進行統計分析。細菌:用 10-7、10-8、10-9接種,各樣各稀釋度接種3皿,1皿對照。霉菌 :用 10-3、10-4、10-5接種 ,各樣各稀釋度接種 3皿,1皿對照。放線菌:用 10-4、10-5、10-6接種,各樣各稀釋度接種3皿,1皿對照。酵母菌 :用 10-4、10-5、10-6接種,各樣各稀釋度接種3皿,1皿對照。

2 結果與分析

2.1 幾種松樹林土壤微生物區系土壤微生物是土壤肥力的重要指標,它的變化除了受土壤理化指標的影響外,還要受地上植物的影響。林木種類不同,根系代謝產物則不同,將會對土壤中的微生物帶來直接的影響。華山松林、混交林、落葉松林的微生物區系測定結果如表1。

表1 不同林地土壤微生物區系分析 個/（g）

落葉松林土壤中霉菌的數量較高,是華山松林土壤中的1.86倍,而細菌數量僅為華山松林的18.6%,放線菌數量僅為18.4%,酵母菌數量僅為15%。混交林的微生物種類與數量分布狀態都處于華山松﹑落葉松之間,這可能與落葉松每年的落葉為土壤提供了大量纖維素等大分子物質誘導土壤霉菌數量的增加有關。這些落葉松的根系分泌物不利于細菌、放線菌、酵母菌的生長,加之大量的松針并不是細菌、放線菌、酵母菌的良好碳源。在細菌數量中纖維素分解菌,因能分解纖維素,其數量在華山松土壤細菌中占5.8%,而在落葉松土壤細菌中占25%。這種現象符合上述推斷。自生固氮菌在華山松土壤細菌中占7.6%,在落葉松土壤細菌中占3.1%。說明落葉松、華山松的根系對自生固氮菌的影響不明顯,在落葉松土壤中略受影響。霉菌中的交鏈孢霉屬在華山松土壤霉菌中占15.9%,而在落葉松土壤霉菌中僅占2.6%,可能落葉松的生長直接制約了交鏈孢霉的生長,曲霉屬在華山松土壤中占霉菌總數的12.7%,在落葉松土壤中占霉菌總數的15.4%；青霉菌屬在華山松土壤中占霉菌總數的50.8%,在落葉松土壤中占霉菌總數的58.1%,說明落葉松曲霉屬﹑青霉菌屬的生長沒有受到抑制作用,所占比例變化不明顯（表2）。

2.2 土壤微生物多樣性分析按照Simpson指數和Shannon-Wiener指數分析,將基本數據整理后列于表3中。在霉菌生物多樣性方面華山松林下的土壤最好,混交林下土壤次之,落葉松林下土壤最差。這個結果與表1的結果是吻合的,也與表1的分析相互印證。在細菌多樣性分析結果中可以看出,落葉松土壤中細菌最好,華山松土壤中細菌均勻度次之,混交林土壤接近華山松。說明混交林、華山松和落葉松根系代謝產物對細菌影響不大。以上數據說明落葉松由于每年產生大量的松針,以及根系代謝產物對霉菌多樣性有促進作用。落葉松的松針以及根系產生的氣味可能對細菌的生長產生抑制作用。

表2 不同林地土壤微生物比例%

表3 不同林地土壤微生物區系多樣性分析

3 討論

不同林木品種會對土壤中微生物區系帶來較大影響,林木的落葉以及根系代謝產物直接影響土壤中微生物的種類與數量。以往研究表明,日本落葉松的引種在一定程度上造成了土壤理化性質的改變,也對該地區的土壤細菌多樣性產生了一定影響,使其群落組成明顯區別于其他林型[27]。本研究從微生物豐富度來分析,結果表明,落葉松林土壤中霉菌的數量較高,是華山松林土壤中的1.86倍,而細菌數量僅為華山松林的18.6%,放線菌數量僅為18.4%,酵母菌數量僅為15%。

土壤中的微生物以其豐富的生物多樣性使它們成為生態系統中最活躍和具有決定性影響的組分之一。已有研究表明,土壤微生物通過相互競爭、協調、驅動養分循環等作用影響著植物多樣性[28-29]。本研究表明,日本落葉松對土壤細菌的生長影響較大,細菌數量減少,但對細菌的均勻度影響不大。華山松的霉菌類群的均勻度比混交林中的差,比落葉松中的更差。日本落葉松可以促進土壤中霉菌數量增加,但抑制細菌、放線菌和酵母菌的生長,使細菌、放線菌和酵母菌的數量減少,影響土壤微生物的豐富度。

天水小隴山林區通過引進外來樹種日本落葉松提高了林區的保護及林木生產功能,但日本落葉松的引進會對當地土壤環境產生一定影響,本研究僅從土壤細菌群落的多樣性方面進行了初步的探討和分析,是否能導致當地土壤生態系統的改變以及改變的機制,還有待于從其他方面進一步加以深入研究。

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