乙型肝炎病毒表面抗體化學發光定量檢測方法的建立

王小明，劉 平

(1、萍鄉市人民醫院，江西 萍鄉 337055；2、重慶醫科大學，重慶 400014)

乙型肝炎由乙型肝炎病毒 (Hepatitis B Virus，HBV)引起的是世界性傳染病，主要通過血液、血制品、性傳播及母嬰傳播，是引起肝硬化和肝癌的常見病因。乙型肝炎病毒表面抗體(HBsAb)是乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg刺激機體產生的特異性抗體，是機體對乙肝病毒產生免疫力的保護性抗體，在肝炎或注射疫苗后產生，是機體對乙肝病毒產生抵抗力的標志[1-3]。通過對血清或者血漿中HBsAb的檢測，可用于監測乙肝疫苗的效果評估或是對乙肝患者病情轉歸的觀察。現行的酶聯免疫法(ELISA)在臨床實驗室廣為使用，但存在不能定量的缺點，不能及時提醒HBsAb低滴度人群再次接受疫苗免疫。而放射免疫法(RIA)存大有效期短，操作繁瑣，環境污染，線性范圍窄等缺點。化學發光免疫測定(CLIA)是一種具有廣闊發展前景的非放射標記微時定量測定技術[4-5]，國外已成功應用，2000年以來，國內一些生物公司也相繼研發出了各種化學發光定量測定試劑盒，本研究旨在建立乙型肝炎病毒表面抗體 (HBsAb)化學發光定量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 純化HBsAg購自美國Fitzgerald 公司；ALP， NaIO4，NaBH4，乙二醇購自 Sigma 公司；Abbott AxSYM系統及配套試劑為美國雅培公司；HBsAb國家定量參考品 (0408-871)和PANEL(0408)購自中國藥品生物制品檢定所；96孔白色化學發光板購自NUNC公司；化學發光免疫分析儀器(BHP9504)購自北京源德生物工程有限公司；標本為空腹靜脈采血4～5ml，分離血清，-20℃保存。

1.2 固相抗體制備 將純化HBsAg單抗用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH 9.6緩沖液稀釋至10mg/L的包被液，微孔板各孔加100μl，37℃包被2h，洗板3次，再以1%BSA 37℃封閉2h，板條密封后置-20℃冷凍保存。

1.3 HBsAg-ALP標記物的制備 10mg HBsAg用0.05mol/L碳酸緩沖液透析至pH9.6，10mg ALP用NaIO40.5mg于 2～8℃活化 1h，用 20μl乙二醇終止，以0.05mol/L碳酸緩沖液透析8h。將活化的ALP與透析后的HBsAg混勻，2～8℃反應2h。再加0.5mg硼氫化鈉(NaBH4)還原。以0.05mol/L碳酸緩沖液透析24h，其中換液三次，加50%體積甘油于-20℃保存。

1.4 HBsAb定標品的制備 篩選多份HBsAb強陽性血清，混勻，離心及過濾，加入0.2%NaN3，以HBsAb國家定量參考品 (濃度分別為 160、106.7 71.1、47.4、31.6、21.1、14、9.4m IU/ml) 標定混合血清HBsAb含量，再以標定好的混合血清以新生牛血清配制成 2000、500、100、20、5、0 m IU/ml，按 1m l/管分裝，-20℃保存。

1.5 發光底物液的配制 配制0.05mol/L的Tris-HCl(pH 9.6)，加入 0.002mol/L的 MgCl2，滅菌。 按 1:10比例加入增強劑Sapphire-II，再加入0.5mol/L金剛烷(AMPPD),2～8℃存放。

1.6 測定方法 采用雙抗原夾心法，即在包被有HBsAg的96孔白色微孔板上，每孔依次加入20μl HBsAb定標品或待測血清，100μl以反應緩沖液1:1000稀釋的HBsAg-ALP標記物，37℃孵育30min后，用洗滌液洗滌5次，拍干。加入100μl發光底物液后第10～20min內測定各孔的相對發光值(RLU)。

1.7 數據分析和統計處理 由儀器自帶軟件繪制HBsAb濃度—RLU的標準曲線，根據待測樣品RLU值，由定量軟件直接計算轉換成其相應的HBsAb含量。

2 結果

2.1 靈敏度 平行測定10孔零值定標品，以零值定標品的RLU±2SD作為試劑的最低檢測限，得出該試劑的靈敏度為2m IU/ml。

2.2 精密性 分別用HBsAb含量為高、低的質控品進行精密性測定，每個質控品測定10孔，結果批內變異分別為6.5%、4.7%、4.4%，批間變異分別8.9%、7.3%、9.1%，見表 1。

表1 批內批間精密性

2.3 準確性 用不同濃度的血清樣品分別測試樣的添加回收率和稀釋回收率。結果添加回收率為92.3～107.6%之間，稀釋回收率為 91.7～110.4%。

2.4 特異性 經檢測20份中檢所陰性參考品，結果全小于10m IU/ml。

2.5 穩定性 把定標品、HBsAg包被板、HBsAg-ALP標記物置于37℃破壞7d后，與4℃保存試劑比較，定標品系列的RLU平均下降到86.4%，靈敏度下降至3.45m IU/ml，其它無明顯差別。

2.6 劑量反應曲線：5～2000m Iu/ml檢測范圍內，HBsAb濃度—RLU的標準曲線γ=0.994，見圖1。

圖1 HBsAb濃度—RLU劑量反應曲線

2.7 臨床符合率： 收集Abbott AxSYM系統檢測過的樣本213份，再以新建立的HBsAb化學發光定量檢測方法進行檢測，經數據分析，其陰性符合率為98.1%，陽性符合率為82.6%。且兩種檢測方法所測數值具有顯著相關性。相關方程為Y=1.0381X＋0.8751 Abbott(n=213)，相關系數 γ=0.941，P＜0.001，見圖2。

圖2 本方法與Abbott系統檢測臨床標本的相關性

3 討論

目前，中國大多數醫院測定乙型肝炎血清標記物均采用ELISA法。ELISA法檢測HBsAb需要分離結合態的抗原(或抗體)與游離態的抗原(或抗體)，因此需要反復加樣和洗版，引入的誤差也就大，加上酶標板的孔間存在差異，方法的變異系數就更大[6]。而采用化學發光法檢測HBsAb，本次實驗結果顯示批內批間變異系數均<10%。

另外，ELISA方法僅為定性或半定量檢測，無法準確測定HBsAb量；而CLIA法作為定量檢測的方法，其靈敏度高，從本次實驗可知其檢測HBsAb的靈敏度可達2m IU/ml。WHO推薦，當HBsAb濃度達到10m lU/ml以上時，才對機體具有保護作用。因而采用CLIA法滿足了對于臨床的指導作用。同時采用定量方法測定HBsAb，根據血清HBsAb含量可判斷機體對HBV的免疫狀態及乙肝疫苗的免疫效果，特別是評價全面免疫的接種效果有重要意義[7-9]。

因此，我們建立的化學發光HBsAb定量檢測方法，從現有的分析指標結果來看靈敏度高、特異性強、檢測范圍寬、無放射性污染，并且操作簡單、測定結果可靠，有著廣闊的應用前景。

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