顯色原位雜交(CISH)技術(shù)在檢測乳腺癌HER-2/neu基因狀態(tài)中的應(yīng)用

王 建，張功亮，肖軍蘭，郭廣秀，黃金長，湛 曦，曾金林

(江西省贛州市人民醫(yī)院病理科，江西 贛州 341000)

生物治療已成為21世紀腫瘤治療的主要方向和潮流，更好地將生物治療和其他治療手段結(jié)合，提高治療效果和改善生存質(zhì)量，無疑將有助于生物治療在腫瘤綜合治療中發(fā)揮重要作用。利用顯色原位雜交(CISH)技術(shù)檢測原發(fā)性乳腺癌組織中HER-2/neu的基因表達狀態(tài)，對于分析其臨床意義、指導(dǎo)臨床用藥等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 我院2006年1月～2010年6月期間收治的經(jīng)手術(shù)根治切除并經(jīng)術(shù)后病理證實的216例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織標本。患者均為女性，年齡30～73歲，平均48±7.15歲。全部病例術(shù)前均未行化療或放療。標本均先行免疫組化(IHC)檢測后，再進一步行顯色原位雜交(CISH)檢測。所有標本均同時進行雌激素(ER)、孕激素(PR)表達的檢測。

1.2 檢測方法

1.2.1 IHC檢測方法 試劑：邁新公司KIT5020試劑盒，操作流程按說明書進行，TBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 CISH檢測方法 收集并保存乳腺浸潤性導(dǎo)管癌石蠟標本；石蠟切片厚 4μm，60℃烤片 2～4h，脫蠟，水化，加熱預(yù)處理液煮沸20min，胃蛋白酶消化20min，脫水，晾干，每片滴加10μl的探針，雜交膜封片，原位PCR儀共變性5min，37℃溫盒孵育過夜，0.5×SSC 75℃洗滌 5min，滴加鼠抗 DIG抗體，室溫孵育30min，PBS沖洗，滴加HRP-抗鼠抗體，室溫孵育30min，PBS沖洗，DAB顯色30min。每次實驗均以試劑盒中提供的對照片作為陰陽性對照。

1.2.3 結(jié)果判斷

IHC及CISH檢測結(jié)果的判斷標準見表1與表2。

表1 免疫組化(IHC)檢測結(jié)果的判斷標準表

表2 顯色原位雜交(CISH)檢測結(jié)果的判斷標準表

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.0統(tǒng)計學(xué)軟件，用Fisher＇s Exact Test和 kappa一致性檢驗對 IHC與CISH的檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

IHC與CISH檢測結(jié)果顯示 (見表3)：216例標本中，111例IHC HER2蛋白 3+中CISH顯示擴增者 102例 (擴增率 91.1%)，58例 IHC 2+中 CISH 顯示擴增者 33例 (擴增率 56.9%)，17例 IHC 1+中CISH顯示擴增者4例 (擴增率23.5%)，30例IHC 0中CISH顯示擴增者2例(擴增率6.6%)，兩種方法總符合率 77.3%(167/216)，兩者明顯相關(guān)(P＜0.01)。CISH檢測的HER2基因擴增與雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)的關(guān)系(表4)顯示：216例標本中基因擴增例數(shù)142例，無擴增者74例；ER陽性者為88例，陰性者128例；PR陽性者為94例，陰性者122例。基因擴增表達與ER、PR蛋白表達呈負相關(guān)性(P＜0.01)。

表3 浸潤非特異性導(dǎo)管癌HER2基因表達IHC與HER2CISH檢測結(jié)果比較(例數(shù))

表4 浸潤非特異性導(dǎo)管癌HER2基因CISH檢測結(jié)果與ER、PR蛋白表達關(guān)系

3 討論

乳腺癌經(jīng)傳統(tǒng)的根治性手術(shù)后，仍有約一半患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，故目前主張綜合治療，化療是乳腺癌術(shù)后最重要的治療方法之一。HER2/neu是公認的重要腫瘤分子標志之一，其過度表達是多種惡性腫瘤的的表型。目前日益增多的證據(jù)表明，HER-2在20～30%的乳腺癌中過表達，是與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)的基因之一[1]。乳腺癌HER-2基因擴增或過度表達的這類患者其腫瘤惡性程度高、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移發(fā)生早、預(yù)后差，且對某些化療藥物有抵抗而使化療及三苯氧胺治療效果不佳，同時它還與患者的無病生存和總的生存期有關(guān)[2]，它可作為乳腺癌的一個獨立預(yù)后指標，對于其預(yù)后評價及指導(dǎo)乳腺癌的治療有著重要的價值，由此可見，合適的化療方案選擇依賴于準確的HER-2/neu水平的檢測。因此，乳腺癌患者HER-2水平檢測可以作為制定治療方案、治療反應(yīng)預(yù)測以及預(yù)后評價的指標。

HER-2狀態(tài)的檢測方法有多種，目前常用的且通過FDA批準的有兩種，即免疫組織化學(xué)(IHC)法和檢測HER-2基因的熒光原位雜交(FISH)法。IHC方法因其操作簡單，判讀方便，價格低廉，便于保存而被臨床廣泛采用，但由于這種半定量的檢測方法因標本的固定、包埋、不同抗體敏感性的差異、評估體系的不同、技術(shù)誤差，以及觀察者主觀判斷的不同造成其結(jié)果不易判斷，準確率低[3]，會遺漏15～20%陽性標本。雖然FISH在檢測HER-2/neu基因擴增時具有良好的特異性和敏感性，后者一直被認為是HER-2診斷的金標準，但其方法費時、價格昂貴，所需設(shè)備復(fù)雜并需特殊的照相機記錄暫時的信號及不能觀察組織形態(tài)學(xué)等缺點限制了其在臨床中的使用。CISH是在近幾年開始被應(yīng)用的檢測方法，它們是一種在組織切片、細胞涂片及染色體制片上對核酸進行定性、定位和相對定量研究的一種分子生物學(xué)方法，具有靈敏、特異、直觀等優(yōu)點,而且價格便宜，易于操作，便于基層普及。

另外，HER2基因高表達時細胞酪氨酸蛋白激酶系統(tǒng)具有持續(xù)活性,從而不再需要內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，關(guān)閉了激素調(diào)控致ER、PR陰性。同時 HER2的過度表達者顯示出癌細胞的分化降低和停滯，不能對內(nèi)分泌治療產(chǎn)生反應(yīng)。因此，HER2表達與ER、PR優(yōu)化組合，可能成為乳腺癌術(shù)后擬定治療方案的重要依據(jù)，有望成為乳腺癌病理常規(guī)測定方法[4]。本組試驗數(shù)據(jù)與多數(shù)文獻報道基本一致，ER及 PR陽性者,該基因表達陽性率分別為31.82%和43.62%，ER、PR陰性者分別為89.06%和82.79%，HER2過度表達與ER、PR狀況呈負相關(guān)(P＜0.001)。因此，臨床上可以把乳腺癌組織的 HER2基因過度表達的檢測結(jié)果與ER和PR表達狀況結(jié)合考慮，運用于判斷乳腺癌的預(yù)后及擬定術(shù)后更合理的治療方案。對于HER2癌基因過度表達患者，應(yīng)加強術(shù)后放療及化療，以爭取延長生存時間；而 ER、PR陽性及HER2癌基因表達陰性且腋窩淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，術(shù)后以內(nèi)分泌治療為主，以減少放療、化療副反應(yīng)及減輕經(jīng)濟負擔。

總之，IHC是HER2表達初步篩查的首選方法，由于蛋白表達和基因擴增檢測結(jié)果存在明顯相關(guān)性，符合率高，建議IHC(+++～+)患者可進一步作基因擴增檢測確診。而CISH檢測價格便宜、易于操作、設(shè)備要求不高，易于推廣應(yīng)用。如條件限制，一定程度上可用CISH檢測HER2基因擴增方法來替代FISH檢測的方法。CISH檢測HER2基因的同時進行ER、PR的檢測，更有利于臨床治療方案的選擇。

[1]Dennis JS,Gary MC,Stenven GW,et al.Human breast cancer:correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene[J].Science,1987,235(4785):177-182.

[2]Beth strauss BSMS.Best hope or last hope access to phaseⅢclinical trials of HER-2/neu for advanced stage breast cancer patients[J].Journal of Advanced Nursing,2000,31(2):259-266.

[3]Press MF,Hung G,Godolphin G,et al.Sensitivity of Her-2/neu antibodies in archival tissue samples:potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression[J].Cancer Res,1994,54(10):2771-2777.

[4]Geisler S,Lonning PE,Aas T,et al.In fluence of Tp53 gene alterations and c-erbB2 expression on the response to treatment with doxorubicin in locally advanced breast cancer[J].Cancer Res,2001,61(6):2505-2512.