36例血友病A相關抑制物檢測分析

伍柏青，程洪波，龔旭疆

(江西省人民醫院，江西 南昌 330006)

血友病A又稱凝血因子Ⅷ缺乏癥，是一種臨床上最常見的由于FⅧ基因突變所引起的X染色體隱形遺傳性出血性疾病 。目前臨床上以替代治療為主，即間斷輸注外源性凝血因子Ⅷ以維持機體正常的凝血功能，但少數患者在經過若干次Ⅷ因子制劑的輸注后，可產生抗Ⅷ因子抗體，使外源性凝血因子Ⅷ失活而影響治療效果，該抗體被稱為凝血因子Ⅷ抑制物。本研究對36例血友病A患者進行FⅧ抑制物定性及定量分析，從而判斷患者抗體存在狀況，進而指導臨床診斷和治療，現報告如下。?

材料與方法

1研究對象 資料來源于2009年11月～2010年8月間，我院血液科收治的診斷明確、資料完整的血友病A患者36例，均為男性患者，年齡范圍從1歲～50歲，13歲以下26例。

2試劑與儀器 標準人類血漿、因子Ⅷ活性測定試劑、APTT試劑、PT試劑、氯化鈣溶液等試劑購自德國SIEMENS公司,所有檢測在日本Sysmex CA-7000全自動血凝分析儀上進行。

3 方法

3.1 血友病A確診試驗 每個病人進行PT、APTT、和VIII:C測定。

3.2 血友病A抑制物定性試驗

3.2.1 取20份以上無黃疸、無溶血、無脂濁且APTT結果范圍為28～32s的血漿混合在一起，制成正?；旌涎獫{備用。

3.2.2 準備3個塑料試管分別標記A、B、C，在A管內加入0.5ml正?；旌涎獫{，B管內加入0.5ml血友病A患者血漿，C管內加入正常混合血漿和血友病A患者血漿各0.2ml。將3管血漿均37℃孵育2h，再將A管和B管1:1混合形成D管。即刻對A、C、D管進行APTT檢測。

3.2.3 結果判斷 C管APTT結果與A管相差10s以上，且C管APTT結果明顯長于D管，說明血漿中存在時間依賴性凝血因子抑制物，即FVIII抑制物定性試驗陽性。

3.3 Nigmegen方法定量檢測抗體

3.3.1 抗體單位定義 37℃孵育2h后，中和正常血漿(FVIII活性100%)中50%的FVIII所需抑制物的量為1BU。

3.3.2 Nijmegen混合血漿的制備 采集20份健康人全血各5ml(以咪唑枸櫞酸鈉抗凝)，立即分離血漿，混合后備用。

3.3.3 Nijmegen血漿定標 將上述制備的混合血漿FVIII活性調整為100%后，加等量的乏VIII因子血漿混勻作為標準品進行定標。

3.3.4 抑制物定量檢測 將患者血漿用緩沖液稀釋，再加入等量Nijmegen血漿后置于37℃水浴2h(加蓋)。用一期法進行因子活性檢測，檢測各管的FVIII:C水平。

3.3.5 取最接近50%活性的稀釋度，利用計算公式log(100/50)(100/Ⅷ:C)，然后乘以相應的稀釋倍數即為該份標本的抗體滴度。

結 果

1 全部36例血友病A患者PT、APTT、和FVIII:C 以及抑制物定性試驗和定量結果見表1。表中所示：A為正常混合血漿APTT結果；C為混合血漿和患者血漿1:1混合再孵育后APTT結果；D為混合血漿和患者血漿孵育后再1:1混合的APTT結果。

表1 36例血友病A檢測結果

2抑制物定性試驗結果：07、28號患者存在時間依賴性凝血因子抑制物，定性試驗陽性，其它均為陰性。

3抑制物定量結果：

07 抗體計算：log(100/50)(100/49.1)×32(稀釋倍數)=log10(100/49.1)/log10(100/50)×32=0.3089/0.3010×32≈33BU

28 抗體計算：log(100/50)(100/51.6)×64(稀釋倍數)=log10(100/51.6)/log10(100/50)×64=0.2874/0.3010×64≈61BU

討論

血友病A是X染色體連鎖的隱形遺傳性疾病，女性常是攜帶者(患者極為罕見)，而男性則是患者。其發病率各國報道不一，國外報道為(4.6～14)/10萬，我國1999年邵宗鴻等報道為 (1.95～2.40)/10萬，而世界衛生組織(WHO)和世界血友病聯盟(WFH)的資料顯示，血友病A的發病率約為1/10000，其中重型的發生率為1/16000[1]。血友病A的主要臨床表現是自幼反復發生多處組織器官異常出血，其中關節出血是最常見且具有特征性的出血表現，也是血友病患者致殘的主要原因[2]。本文收集的36例患者均有不同程度的出血，關節因出血畸形的有5例，其中1例為雙踝關節蹠屈位跟骨截骨手術患者，該患者圍手術期使用了大量Ⅷ因子，但連續的FⅧ抑制物監測始終陰性。

血友病A的診斷主要依賴實驗室的診斷，一般分為篩選試驗：活化部分凝血活酶時間(APTT)，確診試驗：Ⅷ因子活性檢測(FⅧ:C)；而血友病A的抑制物檢測則有定性試驗(APTT糾正試驗)和抗體定量檢測，定量檢測方法主要有經典的Bethesda方法和改良的Nijmegen方法，Nijmegen方法是在前者的基礎上進行改進，將患者血漿用緩沖液稀釋后加正常人混合血漿(咪唑枸櫞酸鈉抗凝)共同溫浴以保證檢測體系pH值的穩定，結果更加可靠，適合低滴度抗體的檢測[3]。

血友病A的治療主要有替代治療和基因治療兩種，由于基因治療效果和安全性方面還存在一定的不足，目前臨床上治療仍以輸注血源性或基因重組FⅧ制劑為主。但有少數患者輸注替代FⅧ后會產生中和抗體，這種抗體嚴重影響FⅧ輸注效果，尤其是患者發生大出血時，不能通過輸注FⅧ來有效提高患者血液中FⅧ濃度，直接威脅患者生命安全。因此，FⅧ抑制物的檢測對進行替代治療的患者就顯得尤為重要。本研究針對我院資料完全的血友病A患者在多次輸注FⅧ制劑后，進行抑制物檢測，觀察有無抗體的產生，評估其治療效果。36例患者抑制物定性試驗陽性的2例，再進行抗體定量檢測，抗體分別為33BU和61BU。

FⅧ抑制物是臨床上最常見的引起出血的凝血因子抑制物，產生主要受遺傳和環境因素影響，其中遺傳因素包括：FⅧ基因突變、疾病的嚴重程度，抑制物家族史，種族和HLA基因型等；環境因素包括：首次使用FⅧ制劑的年齡，FⅧ暴露天數、患者免疫狀態及伴隨炎癥因素等[4-7]。FⅧ抑制物存在的患者往往出血癥狀突然加重，頻率增加，以往的治療常發生無效的現象。治療原則為迅速止血和清除抗體，考慮抑制物的滴度和患者的出血情況。止血主要采用的生物制劑和藥物有：人FⅧ濃縮物、重組的FⅧ濃縮物、豬FⅧ濃縮物以及FⅧ旁路制劑(活化凝血酶原復合物濃縮劑、重組活化的FⅦ)，清除抗體使用的方法有血漿置換、免疫耐受等[1]。我們檢出的存在抑制物的患者臨床觀察發現用常規治療方法效果較差，出血仍在繼續。但在加大輸注Ⅷ因子和使用一些清除抗體的方法，病情有所好轉。其中1例患者3個月內連續檢測其抗體滴度，顯示依次為61BU→53BU→44BU下降趨勢，病情也有所緩解。本研究對輸注Ⅷ因子的血友病A患者進行抑制物作定性定量檢測，能盡早發現患者抗體的產生，有助于臨床對該疾病的早診斷、早治療和預后判斷。

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