慢性乙型肝炎患者外周血T、B淋巴細胞變化與其HBV-DNA的水平相關性探討

鄭源海，周艷貞，林元峰，周藝華

(福建醫科大學附屬漳州市醫院檢驗科，福建 漳州363000)

乙型肝炎病毒(HBV)是一種非細胞毒性病毒，其所致的肝細胞損壞是由機體針對HBV特異性抗原的免疫反應所引起，HBV感染所致的不同臨床結果與機體不同的免疫狀態密切相關[1]。機體免疫功能及病毒逃逸免疫的能力決定了HBV感染發生，發展和轉歸[2]。本文采用直接免疫熒光法通過流式細胞儀檢測HBV感染者外周血T淋巴細胞亞群(CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+)、B 淋巴細胞 (CD19+)及采用FQ-PCR檢測血清中HBV-DNA載量水平，來評價HBV感染后血清HBV-DNA水平與機體免疫功能變化的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 91例慢性乙肝病毒(HBV)感染者，男64例，女27例，年齡 17～75歲，平均年齡36.9歲，符合2000第十次全國病毒性肝炎及肝病學術會議修訂的病毒性肝炎診斷標準。正常對照組31例，其中男21例，女10例，年齡22～70歲。平均年齡35.7歲，均為我院體檢中心體檢合格的健康人。

1.2 儀器和試劑 IMMUNO-TROLTMCells標準品、CD19-PE、 CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5熒光標記抗體及紅細胞裂解液 (Opti Lyse○RC)購自法國Immunotech公司，流式細胞儀為Beckman-Coulter公司生產的Epics-XL型流式細胞儀，HBV核酸熒光定量PCR試劑盒為廈門安普利生物工程有限公司生產，PCR擴增儀為Amplly公司的GeneLight9800熒光定量核酸擴增儀。

1.3 標本收集 抽取靜脈血6ml分三管，一管用EDTA-K2抗凝，用于流式細胞術檢測；另兩管為分離膠管，分離血清后用于HBV及HBV-DNA病毒檢測。

1.4 檢測方法 采用IMMUNO-TROLTMCells標準品進行校正。各取100μl抗凝血于流式專用試管中，分 別 加 入 20μl CD19-PE、CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5熒光標記抗體，室溫閉光反應20min，加入500μl紅細胞裂解液，溶解紅細胞15min，加入500μl鞘液混勻，1000rpm/min 離心 5min，棄上清，再加入500μl鞘液，混勻后上機檢測并記錄熒光抗體染色陽性 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+及 CD19+百分率。HBV-DNA定量分析采用熒光定量PCR法，嚴格按照試劑說明書步驟進行，HBV-DNA檢測單位IU/ml表示。

1.5 統計學分析 采用t檢驗，應用SPSS13.0數據統計軟件分析實驗結果，P＜0.05為明顯差異，P＜0.01為顯著差異。

2 結果 見表1。

3 討論

CD3分子構成TCR/CD3復合體為T細胞的特異性表面分子。根據T細胞表面表達CD4+CD8+分子，又分為T輔助/誘導細胞亞群(CD3+CD4+)和T抑制細胞亞群(CD3+CD8+)。TH細胞可產生多種淋巴因子，在體液免疫和細胞免疫的調節中起關鍵作用，在病毒的免疫應答中發揮中心作用；同時，對病毒清除起重要作用[3]。CD8+T細胞激活和抑制嚴格依賴CD4+TH細胞，正常情況下，兩者保持一定的比例，維持機體的細胞免疫功能。TCR/CD3復合體是CD3+T細胞與T細胞抗原受體的獨特結構(TI)結合形成的，傳遞信息。所以T淋巴細胞狀態直接反映細胞免疫狀況。本文結果表明DNA低拷貝組、高拷貝組的CD3+T細胞百分率及CD3+CD4+T與對照組、DNA陰性組比較明顯減低，表明感染者特異性T細胞作用有所加強，而T輔助/誘導細胞亞群(CD3+CD4+)細胞生成減少，使特異性抗體產生不足，不能清除游離的乙肝病毒,可造成病毒在體內持續存在。CD4+/CD8+比值可監測人體細胞免疫功能，反映機體免疫狀態的重要指標，比值失衡可能造成免疫紊亂和一系列免疫病理改變。本實驗結果表明，與正常對照組、DNA陰性組比較，低拷貝組、高拷貝組CD4+/CD8+比值顯著差異 (P＜0.01)，與相關報道一致[4-5]。 動態觀察該比值的變化趨勢可以反映HBV-DNA體內復制情況。

表1 HBV感染者外周血T、B淋巴細胞與HBV-DNA載量水平分析

人體體液免疫是機體免疫應答的重要組成成分之一，在人體特異免疫功能中起著重要的作用，是致敏B淋巴細胞受抗原刺激后，即轉化為漿細胞并產生能與相應抗原結合的抗體[6]。B淋巴細胞作為人體的主要體液免疫細胞，其細胞表面標志已被人們所認識，CD19+細胞代表B淋巴細胞水平。乙型肝炎病毒并不直接引起肝細胞的損傷，而是由于感染乙型肝炎病毒后引起人體細胞免疫和體液免疫應答造成的。本研究發現，慢性乙肝病毒(HBV)感染者的各組CD19+明顯高于正常對照組(P＜0.05)。說明體液免疫在慢性肝炎的病程中起到關鍵作用，B淋巴細胞產生的抗體能對血液中的乙型肝炎病毒進行反應加以殺滅。

綜上所述，通過對HBV感染者外周血T淋巴細胞亞群及B淋巴細胞檢測，可及時提示HBV感染者免疫功能的變化并加強臨床監測。

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[5]劉 明,沈 韻,陸 穎,等.慢性乙型肝炎病毒感染者外周血T細胞亞群化與其血清HB-DNA的水平分析[J].中國實驗診斷學,2008,12(2):232-235.

[6]楊紹基.傳染病學[M].第7版,北京:人民出版社,1999:5.