國產化學發光分析系統檢測睪酮的臨床驗證

林 云 ，汪先桃 ，劉 萍

(1、云南省中醫醫院檢驗科，云南 昆明 650021；2、博奧賽斯(天津)生物科技有限公司，天津 300203)

以往全自動化學發光分析系統主要以國外產品為主，而隨著國內科技產業發展和衛生保健事業的需要，國內開始了全自動化學發光分析系統研發工作，并有產品推出。為評價國產Bioscience PETECK96-I全自動化學發光分析系統與羅氏電自動化學發光分析系統檢測睪酮(Testosterone,以下簡稱T)是否等效，研究按照國家關于新藥臨床驗證的指導原則和體外診斷試劑臨床研究技術指導原則[1]、NCCLS指南文件[2]，進行該系統檢測睪酮的臨床性能測試。

1 材料與方法

1.1 材料 對照系統：羅氏公司化學發光全自動免疫分析儀 Elecsys2010，國藥管械(進)字 2002第3400335號。配套T檢測試劑盒，國食藥監械2008第2400661號，試劑盒批號：155387-02，參考值：男性 2.8～8ng/mL，女性 0～0.82ng/mL。 驗證系統：博奧賽斯 (天津)生物科技有限公司Bioscience PETECK96-I化學發光免疫分析系統。試劑：為配套T試劑、校準品和質控品。

1.2 方法

1.2.1 臨床檢測樣品 根據國家關于體外診斷試劑盒二類臨床試驗的要求，收集了120例樣本，均來自本院就診的門診及住院病人。樣本均為空腹時抽取的靜脈血，自然凝血后，離心分離出血清，去除嚴重溶血、脂血、黃疸的樣本于-20℃保存，每份標本不少于500μl。所有待測樣本濃度均應≤20ng/ml，其中超出醫學決定水平值樣本50例。

1.2.2 臨床試驗對照產品的確定 羅氏公司生產的化學發光全自動免疫分析系統可以定量檢測T，經國內外同行的評價，認為此系統及其配套T檢測試劑盒為國際一流的水準[3]，因此，本臨床試驗以Roche 2010電化學發光全自動免疫分析系統(Elecsys 2010)對T的測定值作為“金標準”，以此考查天津博奧賽斯公司研制的Bioscience PETECK96-I化學發光分析系統使用其配套T檢測試劑盒的檢測結果是否等效。

1.2.3 統計學處理 結果以x±s表示，采用SPSS 13.0統計分析軟件對Elecsys2010的測定值和Bioscience PETECK96-IT的測定值兩組數據進行配對t檢驗(檢驗水準α=0.05)、線性相關和回歸分析并評價。

2 結果

2.1 準確性

用試劑盒對試劑盒校準品進行雙孔檢測，用Log(X)-Logit(Y)數學模型擬合，對兩條劑量-反應曲線進行斜率t檢驗；以國家標準品系列為標準，計算試劑盒校準品的實測濃度，并計算5個校準品實測濃度與理論濃度比值的平均值。結果見表1。

斜率t檢驗結果t=1.21，∣t∣≤2.447，兩條直線不明顯偏離平行；實測濃度與理論濃度平均差異小于10%，說明試劑盒校準品定值準確。試劑盒校準品相關系數絕對值∣γ∣＞0.99線性良好。

表1 準確性：試劑盒校準品檢測結果

2.2 精密性

用三批試劑盒對質控品QcL和QcH進行10孔重復測定，統計實驗結果的標準偏差(SD)和平均值。由SD和 的比值計算得到批內和批間的變異系數CV。結果見表2。

表2 精密性

由上表知本產品的批內CV小于15%，批間CV小于20%。

2.3 參考范圍的測定

選擇1186份健康人群血清樣品，其中成年男性132例、成年女性956例和男性兒童98例，建立90%置信區間。結果見表3。

表3 參考范圍

2.4 特異性測試

臨床上T的主要類似物是雌三醇(E3)和雌二醇(E2)，孕酮(P)。 用二甲亞砜分別溶解 E3、E2、P，然后用稀釋液2#分別稀釋到1000ng/mL，用試劑盒檢測。結果見表4。

表4 交叉反應

當 E3、E2、P 的濃度分別為 1000、1000、1000ng/ml時，沒有發現交叉反應。

2.5 試劑盒測定范圍及最低檢測限

實驗方法：將T濃儲液稀釋成系列濃度，加樣量為每孔50μl；然后每孔加入50μl的T酶結合物，37℃溫育30分鐘，洗滌5次，每孔加發光液100μl，5min后讀數。結果見表5。

表5 試劑盒測定范圍及最低檢測限數據表

試劑 在0.1～20ng/mL范圍內成線性發展，試劑盒最低檢測限可達0.1ng/ml。

2.6 兩種系統測定值配對t檢驗統計分析 結果見表6。

表6 兩種方法測定值比較

2.7 兩種系統測定值相關性分析

以Elecsys2010的測定數值為橫坐標，以Bioscience PETECK96-I的測定數值為縱坐標，利用EXCEL軟件做圖(圖1)，計算相關系數γ和回歸系數并進行t檢驗。直線方程為Y=1.0348X–0.0335，線性回歸系數為1.0348，相關系數為0.9413。以SPSS 13.0對相關系數進行 t檢驗 (檢驗水準α=0.05)，P＜0.001，兩種方法測定的T值密切相關。回歸系數為1.0348，表明兩種方法之間測定的T值一致性良好。

2.8 測定值不一致的分析

經對數據的統計分析，120例樣本中有6例測定值結果不一致(占5.0%)，對于不符合的樣本，經重復性檢測，測定值沒有明顯改變。使用Elecsys2010進行復測，復測2例與Elecsys2010結果一致，4例與Bioscience PETECK96-I結果一致(見表7)。經分析沒有規律性的偏差產生，多為臨界偏差，所以考慮產生不一致的原因主要可能由樣本病例的個體差異、兩種方法測定原理的差別及操作隨機誤差造成的。

表7 兩種不同檢查方法吻合度對比

3 討論

T是男性激素，T促進男性第二性征的發育，維持前列腺和精囊的功能。血循環中的T絕大多數與載體蛋白質結合[4]，T在體內的含量不高。CLIA法是利用抗原抗體間免疫反應的高親和力、高度特異性和化學發光的高敏感性建立起來的一種微量免疫定量測定技術，采用化學發光免疫分析(CLIA)法檢測T濃度具有靈敏度高、線性檢測范圍寬、操作簡單、定量和穩定的優點[5]。

Bioscience PETECK96-I的配套T定量檢測試劑盒采用競爭抑制法，以辣根過氧化物酶(HRP)為標記物，樣品中的T濃度依據由標準品T濃度建立的數學模型進行定量，從而檢測人血清中T的含量。

檢測儀器的系統性能測試數據是臨床實用的重要指標，每一項測試必須按照國家關于新藥臨床驗證的指導原則和體外診斷試劑臨床研究技術指導原則和NCCLS指南文件嚴格操作。

Bioscience PETECK96-I測定T的精密度 CV<20%，參考范圍符合臨床應用，臨床常見干擾物質對T的檢測，無統計學意義，臨床線性范圍為0.1～20ng/ml，能達到臨床檢測要求。比對試驗中，同組測試中采用Roche 2010電化學發光全自動免疫分析系統(Elecsys 2010)對T的測定值與天津博奧賽斯公司研制的Bioscience PETECK96-I化學發光分析系統使用其配套T檢測進行對比試驗。兩組數據比較P＞0.05，差異無統計學意義，兩組數據線性回歸系數為1.0348，相關系數為0.9413總體可比性較好。Bioscience PETECK96-I的靈敏度、特異性高，測定結果穩定。

綜合研究結果分析，Bioscience PETECK96-IT定量檢測與Elecsys 2010對T的測定值等效，該系統達到臨床測定要求，可用于臨床檢測。

[1]國家食品藥品監督管理局令(第3號).藥物臨床試驗質量管理規范[S].北京:國家食品藥品監督管理局,2003.

[2]Clinical and Laboratory Standards Institute．EP9-2A，Method comparison and bias estimation using patient samples，approved guideline[S].Pennsylvania.CLSI,1986.

[3]陽 蘋.羅氏MODULAR E170全自動電化學發光免疫分析儀性能驗證[J].重慶醫學,2009,38(19):2395-2397.

[4]辛鐘成.老年男性雄激素缺乏綜合征和睪酮補充療法的研究進展[J].中華老年醫學雜志,2003,22(6):333-334.

[5]尹東光,賀佑豐.促甲狀腺激素化學發光免疫分析的研究[J].分析化學,2004,32(7):45-47.