時間依賴性熒光衰減對HLA-B27檢測結果的影響

左 芳 ，程 暉 ，饒錦秀，翟中良，汪宏良

(1、湖北省黃石市中心醫院醫學檢驗科，湖北 黃石 435000；2、黃石理工學院醫學院醫學檢驗系 435000)

流式細胞術(Flow cytometry，FCM)是20世紀70年代發展起來的對單細胞定量分析的一種新技術，通過對流動液體中排成單列的細胞或顆粒進行逐個分析、測定細胞或顆粒的光散射和熒光情況，獲取其大小、內部結構、DNA、RNA等理化特性。它借鑒了熒光技術、激光技術，單抗技術及計算機技術等多門學科和技術，有檢驗速度快、測量指標多、采集數據量大、對所需的細胞或顆粒可以進行分選等特點，廣泛應用于基礎研究和臨床實踐等各個方面[1]。批量標本檢測時，隨放置時間的延長，標本的熒光強度會發生一定的變化，我們對HLA-B27檢測中熒光衰減與實驗結果間的關系作了研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 按照1984年紐約修訂的AS(Ankylosing spondylits，AS)診斷標準[2]，選擇 2008 年6月～2010年6月本院門診及住院AS患者56例，其中男性41例，女性15例，年齡18～41歲，平均年齡29.6歲。

1.2 實驗儀器及試劑 EPICS-XL流式細胞儀由美國貝曼庫爾特公司生產，標記物(HLA-B27-FITC/HLA-R7-PE)、陰性對照(IgG2a-FITC/IgG1-PE)、溶血劑 (Optilyse)、鞘液(Cell Sheath)、清洗液均由美國貝克曼公司提供。

1.3 實驗方法 患者早晨空腹采取靜脈血，EDTA-K2抗凝，混勻后待檢。抗凝血100μl加入HLAB27-FITC/HLA-B7-PE 10μl后混勻，室溫避光放置15min后加溶血劑500μl，室溫避光放置20min。加鞘液500μl后2000r/min離心2min，棄上清液，混勻后再加鞘液500μl后2000r/min離心2min，棄上清，混勻加鞘液500μl，上機測定，每份樣本檢測均設陰性對照及熒光補償。將56份陽性標本經過預處理后，立即上機檢測，獲取MFI值。此后，避光放置，分別 在 30min、1h、2h、4h、6h、8h 進 行 重 新 檢 測 獲 取MFI值。

1.4 檢測與結果判斷 計數HLA-B27陽性/HLAB27陰性細胞，同時記錄其MFI值。若該群占總淋巴細胞百分比大于90%時，且其平均熒光強度大于8判為陽性。

1.5 統計學處理 實驗數據以均數±標準差 (x±s)表示，各組間比較采用t檢驗。

2 結果

56 例陽性標本中，標本放置 30min、1h、2h、4h、6h、8h后檢測后獲取的MFI值，結果見表1。

3 討論

表1 標本在放置不同時間后檢測的結果比較(x±s)

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種侵犯骶髂關節、脊柱的慢性炎癥性疾病，早期診斷、早期治療具有重要的意義，而HLA-B27與AS的相關性則是迄今為止已知的HLA與疾病的關聯中最強和最典型的[3]。有研究發現超過90%的AS患者其HLA-B27表達陽性，而AS由于其癥狀與許多其他疾病相似而難以確診，因此HLA-B27的檢測結果對該病的診斷有重要意義。

流式細胞儀檢測HLA-B27主要是根據直接熒光染色及抗原與抗體特異性結合的原理，使鼠抗人的B27單克隆抗體與人淋巴細胞表面B27抗原結合。而HLA-B27屬交叉反應群成員，是由分擔共同表位的HLA抗原組成的。雖然鼠源的抗HLA-B27的特異性，仍然存在不同程度的交叉反應，而且主要是與HLA-B7的交叉反應，造成假陽性[4]。本實驗中我們采用了雙標記的熒光抗體，因此排除了HLAB7的交叉反應，從而減少了假陽性和假陰性的發生。

樣品細胞的分離與固定、抗體標記、上機測試及數據分析是流式檢驗的一個連貫過程。因此，檢測過程中的準確性與可靠性將直接影響檢驗結果，如：樣本放置時間、樣本的準備、固定的選擇、實驗對照的設立、免疫熒光標記的溫度和時間及設門法對分析結果的影響等等。在實際工作中，我們發現MFI值隨著樣本暴露時間而存在著衰減問題，特別是對于大樣本實驗室，熒光隨時間的衰減會造成對于陰陽性結果的判斷誤差。因此，應盡量將誤差減少到最低，以得到穩定可靠的結果。每次實驗必須進行光路、流路的校正及熒光補償，使儀器達到最佳狀態，每份標本都需做陰性對照，以提高結果的可靠性。

本研究顯示，樣本立即檢測和 30min、1h、2h、4h后檢測的MFI值檢測之間無明顯差異，而樣本放置6h、8h后檢測的MFT值與樣本制備后立即檢測的MFI值之間有顯著性差異，具有統計學意義，這與文獻[5]的報道結果基本一致。因此，制備好的樣本最好在4h內檢測，以提高準確性。

[1]郝彩霞,劉延香.流式細胞術在特發性血小板減少性紫癱臨床研究中的應用[S].安微醫學,2009(30)2:208-209.

[2] Van Der Linden SJ, Valkenburg HA, Cats A. Evaluation of diagnostic criteria for ankylosing spondylitis: aproposal for modification of the New York criteria[J].Arthritis Rheum,1984,27(4):361-368.

[3]李 維.強直性脊柱炎與HLA-B27[J].國外醫學.臨床生物化學與檢驗學分冊,2002,23(5):295.

[4]張 琰,溫 浩,張朝霞,等.淋巴細胞HLA-B27抗原的表達及意義[J].新疆醫科大學學報,2005,28(7):622-623.

[5]曹魯寧,張珍珍,仲人前,等.流式細胞儀檢測人白細胞抗原-B27的影響因素[J].檢驗醫學,2007,22(3):233-234.