探討ELISA法檢測血清結核桿菌抗原對肺結核病的診斷價值

張周云，熊國亮

(江西省胸科醫院檢驗科，江西 南昌 330006)

血清學診斷結核病人抗體已有許多報道，但大多情況不是敏感性不夠就是特異性不強[1]。盡管應用免疫學技術檢測結核病抗原已有20多年的歷史，但相關檢測報道較少。近年來由于單克隆抗體制備技術的提高，取得了高效價的特異性抗體對提高結核抗原檢測的敏感性和特異性起著至關重要作用[2-3]。為了探討檢測血清中結核桿菌抗原對肺結核病的診斷價值，我們應用單克隆抗體，采用ELISA夾心法檢測了139例臨床已確診的活動性肺結核患者血清中結核桿菌分泌蛋白desA抗原，現將結果評價報告如下。

材料與方法

1材料

1.1 標本來源 2010年2月～7月我院結核內科139例活動性肺結核病住院患者，其中男83例、女56例，平均年齡54.3歲；我院呼吸內科、腫瘤科64例非結核性肺部疾病 (27例肺炎、16例慢性支氣管炎、21例肺癌)住院患者，其中男36例、女28例，平均年齡58.7歲。全部病例根椐臨床表現、體征、X線、CT、細菌學、細胞學、生化指標、免疫學或抗結核治療有效等進行了確診。所有患者均抽取空腹血分離出血清，每個患者的血清分兩部分，一部分當天檢測，另一部分-20℃冰柜保存。29例健康對照血清來自江西省血液中心獻血員。

1.1 .2試劑 為鄭州安圖綠科生物工程有限公司產品，批號：20090813。

2方法

2.1 (1)取出一定量的包被孔，編號。留空白1孔，2孔加入陰性對照100μl，2孔加入陽性對照 100μl，其余各孔加樣品稀釋液100μl，分別加入血清20μl。(2)在微量振蕩器上振蕩30s使孔內液體混合均勻。(3)置37℃下溫育30min。(4)用洗板機洗板6次。(5)每孔分別加入酶結合物100μl，空白孔不加。(6)重復操作步驟(3)(4)。(7)每孔中加入底物、顯色劑各 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光反應10min。(8)加終止液50μl/孔，振蕩混勻，立即用酶標儀450nm/630nm雙波長測定各孔的吸光值。

2.2 結果判定

2.2 .1結果有效性 陽性對照孔OD值應大于0.8，陰性對照孔OD值應小于0.1，否則實驗無效。

2.2 .2 CUT OFF值計算 CUT OFF值=0.1+陰性對照孔平均OD值 (若陰性對照孔平均OD值小于0.05，按 0.05 計算)。

2.2 .3檢測血清OD值≥CUTOFF值時，判為陽性，否則為陰性。

結 果

1方法學穩定性實驗表明，新鮮血清與-20℃冰柜存放30d的血清的結核桿菌抗原檢測結果無差別。

2 139 例活動性肺結核患者血清結核抗原檢出的敏感性為84.1%(117/139)；64例非結核性肺部疾病組結核抗原陽性率7.81%(5/64)，特異性為92.19%，29例健康對照血清檢測全為陰性結果。詳見表1。

表1 二組病例及健康對照組結核抗原檢測結果

3 139 例活動性肺結核患者痰涂片抗酸染色和痰結核桿菌培養結果與血清結核抗原檢出的關系，詳見表2。

表2 痰涂片和痰培養結果與血清結核抗原檢測的關系

從表中顯示，結核桿菌抗原測定陽性與痰涂片陽性一致率為92.73%，結核桿菌抗原陽性與痰培養一致率為93.24%。

討 論

1檢測結核病患者血清結核桿菌抗原可以作為結核桿菌存在的直接證據，也可以避免結核病患者因免疫應答低下導致的體液免疫檢測或細胞免疫檢測的“假陰性”結果。一段時間以來，因檢測結核抗原用的結核抗體存在交叉反應，導致結核抗原檢測的特異性和敏感性低下。近年來由于單克隆抗體制備技術的提高，取得了高效價的特異性抗體，使得臨床上檢測結核病患者的血清中結核桿菌抗原成為可能。本實驗采用的單克隆抗體是利用基因工程方法在體外表達結核分枝桿菌的desA蛋白抗原制備而成[3]，利用該單克隆抗體采用ELISA雙抗體夾心法檢測了139例臨床已確診的活動性肺結核患者血清中結核抗原，結果表明：其敏感性為84.17%，特異性為92.19%。

2實驗結果也表明，血清在-20℃條件下存放30d與新鮮血清的檢測結果無差異，有利于標本少的實驗室集中時間檢測。

3表2 中顯示，痰菌陽性患者與血清結核桿菌抗原檢測陽性的一致性很高 (涂片陽性為92.73%，培養陽性為93.24%)。對菌陰患者血清結核桿菌抗原檢測陽性為78.57%。

4 64 例非結核性肺部疾病患者血清中有5例陽性，查閱該5例病歷都沒有合并結核的情況，為假陽性，因此檢測非結核性肺部疾病患者的假陽性率為7.81%。

綜上所述，采用ELISA雙抗體夾心法檢測活動性肺結核患者血清結核抗原雖有一定的假陽性，但仍有可能成為結核病敏感性高、特異性強的新型診斷方法。檢測血清中結核桿菌分泌蛋白dseA抗原對診斷肺結核病有較高的應用價值。

[1]劉金花,彭澤華.血清結核抗體與特異性CIC測定綜合診斷肺結核病163例[J].江西醫學檢驗,2006,24(5):441-442.

[2]唐宇龍.三種結核分枝桿菌分泌蛋白的抗體制備及其在抗原檢測中的應用[J].中國傳染病雜志,2007,25(10):597-600.

[3]顧 軍.結核分枝桿菌分泌蛋白desA的單克隆抗體及其在結核病血清學診斷中的應用[P].中國專利,200710054376.0,2008.11.12.