一氧化氮對小鼠胚胎附植影響的研究

廖海艷，王方劍，薛立群

（1.湖南第一師范學院，湖南 長沙 410205；2.湖南農業大學動物醫學院，湖南 長沙 410205）

胚胎附植是指胚泡與子宮內膜粘附并植入子宮內膜基質、形成胎盤的過程，成功的植入不僅取決于胚泡滋養層細胞對母體子宮的侵入性，而且取決于子宮對胚泡的相容性和營養供應。前者涉及細胞的黏附、遷移、ECM的降解等，后者涉及蛋白酶對子宮內膜的組織降解、更新以及血管新生。而NO（一氧化氮）是調節血管功能和炎癥反應,介導組織重建和細胞凋亡,影響胚胎發育和附植多種生理過程的一個重要的旁分泌調節因子[1]。生理狀況下，NO、ECM、MMPs、TIMPs（基質金屬蛋白酶抑制劑）、細胞因子、生長因子、細胞等諸多因素之間，存在著復雜的網絡調節控制機制，以適應機體組織正常的胚胎發生和附植、器官形成、組織塑型、創傷修復和動態平衡的需要[2－3]。本試驗是用子宮角注射的方法，在小鼠胚胎附植期子宮角注射NOS的非特異性抑制劑N-硝基L-精氨酸甲酯（L-NAME）或L-NAME+SNP（硝普鈉）來研究一氧化氮（NO）在胚胎植入過程中可能發揮的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料實驗動物為BABL系小白鼠，購自湖南中醫學院小動物實驗室，50日齡,體重20 g左右。實驗鼠在自然光照條件下采用自由采食和飲水的方式飼養。

1.1.2 試劑L-NAME和SNP均由美國Sigma公司提供。L-NAME和SNP的配制:分別稱取適量的L-NAME和SNP，溶于無菌的9 g/L氯化鈉溶液中。

1.2 方法

1.2.1 子宮角注射將雌性、雄性小鼠按2∶l比例合籠，次晨查出陰栓者定為妊娠第l天（D1）。雌鼠于D3下午麻醉后，左側子宮角內注藥，右側子宮角內注入等體積（4 pL）生理鹽水作為對照。

1.2.2 試驗設計實驗分為3組，每組處理小鼠8～l0只。處理1:于附植早期/中期/后期分別處理8～10只；于D2/D4/D6下午麻醉后，注射L-NAME 0.2 mg/只。受試動物分別于注藥后2 d（D4/D6/D8）剖檢，觀察并計數兩側子宮角植入胚胎數,并收集雙側子宮,直接存放于－80℃以制作組織切片。處理2:6～8只雌鼠，D2下午麻醉后，注射L-NAME 0.2 mg+SNP 10μg/只，注藥后6 d（D8）剖檢，觀察并計數兩側子宮角植入胚胎數,并收集雙側子宮,直接存放于－80℃以制作組織切片。處理3（胚胎發育觀察組）:6～8只雌鼠，D2下午麻醉后，注射LNAME 0.2 mg/只。注藥后6 d（D8）剖檢，觀察并計數兩側子宮角植入胚胎數,并收集雙側子宮,直接存放于－80℃以制作組織切片。

1.2.3 子宮組織切片和形態學觀察子宮組織切片的制作是用經10%中性福爾馬林液固定好的子宮組織樣品進行修整，使之符合石蠟組織切片要求，然后進行脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋；進行連續切片，分段取樣鋪片，切片厚度為5μm，對鋪好的玻片放入烘箱，58℃過夜烤片；進行HE（haematoxylin eosin）染色:對烤好的切片進行脫蠟、脫二甲苯、蘇木素染色、鹽酸酒精分化、蘭化、伊紅復染和封片，42℃烘片12 h，用組織切片盒保存備用。在生物顯微鏡或倒置顯微鏡下對切片進行觀察，對特征性圖像進行顯微照相。

2 結果與分析

2.1 NO對小鼠胚胎植入數的影響結果

如圖1至圖4所示，小鼠子宮角注射NOS抑制劑L-NAME后,胚胎植入數出現下降，當L-NAME和SNP合并注射時則使胚胎植入數恢復到正常水平，這說明NO參與了胚胎植入過程的調節。

圖1顯示L-NAME 0.2 mg/只處理后,在胚胎附植前期（D4）、附植期（D6）、附植后期（D8）的兩側子宮角胚胎植入數的變化。由圖可知,子宮角注射LNAME后,子宮角的胚胎植入數受到顯著抑制。

圖1 子宮角注射NOS抑制劑對小鼠胚胎植入的影響

圖2顯示妊娠小鼠于D8子宮角注射LNAME或L-NAME和SNP合并注射對小鼠胚胎植入的影響。從此圖中可以看出,與對照側相比,L-NAME 0.2 mg/只處理組小鼠子宮角的胚胎植入數顯著降低,當L-NAME和SNP（一種NO的自發性供體）合并注射時,對小鼠的胚胎植入數沒有多大影響。

圖2 D8注入NO抑制劑和D8注入NO抑制劑+SNP對小鼠胚胎植入的影響

圖3顯示經左側子宮角注射L-NAME，右側子宮角注射生理鹽水處理后于D8時子宮的發育情況。通過圖片可以看出，與對照側相比,L-NAME處理側小鼠子宮角的胚胎植入數為0個，而對照側為4個胚胎數。由此可見，L-NAME處理側小鼠子宮角的胚胎植入數顯著降低。

圖4顯示經左側子宮角進行L-NAME和SNP合并注射，而右側子宮角注射生理鹽水處理后在D8時子宮的發育情況。通過圖片可以看出，與對照側相比,L-NAME和SNP合并注射處理側小鼠子宮角的胚胎植入數為3個，而對照側為4個胚胎數。由此可見，當L-NAME和SNP合并注射時,對小鼠的胚胎植入數沒有多大影響。

圖3 左側子宮角注射LNAME后于D8時子宮發育情況

圖4 左側子宮角進行LNAME和SNP合并注射后于D8時子宮發育情況圖

2.2 子宮內膜組織形態學觀察結果

為了更進一步了解NO對小鼠胚胎植入的影響，對所收集的子宮均進行了組織切片和組織形態學觀察。通過組織形態學觀察可以發現:在小鼠胚胎附植過程中，NO對子宮內膜的發育有影響。影響表現為對血管的通透性、厚度的變化的影響以及對蛻膜細胞的形成有作用。而子宮內膜的這些結構在胚胎附植的不同時期所表現出的變化特征均有所不同。

在附植前期，通過形態學觀察顯示，妊娠對照側和抑制側的子宮內膜均有一定程度發育,即柱狀上皮細胞開始增高、變大，腺體數目也都開始增多。但妊娠對照側子宮內膜的發育比較明顯，尤其是柱狀上皮細胞增高比較明顯（見圖5）。

圖5 附植前期子宮切片圖（100×；左圖為對照側子宮，右圖為抑制側子宮）

在附植期，通過在400×顯微鏡下仔細觀察可發現，妊娠對照側的子宮內膜進一步發育，單層柱狀上皮細胞增高更加明顯，腺體數目明顯增多,羽狀突起非常明顯；抑制側子宮內膜柱狀上皮細胞相對高度較低，腺體數少，羽狀突起較少。對照側螺旋動脈豐富且擴張，通透性增強，基質細胞形成蛻膜細胞，發生明顯的蛻膜樣變，基質變得疏松，同時子宮內膜腺呈現出明顯的活動狀態;而抑制側子宮內膜基質則相對致密，螺旋動脈的分布也不是很明顯（見圖6）。

圖6 附植期子宮切片圖（400×；左圖為對照側、右圖為抑制側）

3 討論

本研究采用子宮角注射法研究了NO對小鼠胚胎植入的影響，以探討NO在胚胎植入中的作用機理。子宮角注射法所使用的藥物劑量小，可以顯示出藥物對胚胎植入的直接影響和局部作用[4]。通過子宮角注射L-NAME后，子宮中NO的產生確實受到了抑制。SNP是一種NO釋放劑，它可自發釋放NO，當在L-NAME中加入SNP后再對小鼠進行子宮角注射，結果發現，處理側的胚胎植入數沒有明顯的變化。以上實驗結果表明，NO在小鼠胚胎植入過程中起重要作用。這個作用具體通過什么來實現，還有待于進一步研究。沈政等[5]采用小鼠胚泡體外植入模型，利用NOS抑制劑L-單甲基-精氨酸、NO供體s-亞硝基-乙酰青霉胺8-BrcGMP對胚泡黏附擴展以及MMP-2分泌的影響進行了研究，發現NO能促進體外小鼠胚泡的黏附、擴展及MMP-2的分泌，提示NO的這些作用可能是通過cGMP來實現的。

子宮血管通透性的增強是著床的一個標志，子宮充足的血液供給對于胚胎著床是十分必要的。在血管中，NO由eNOS催化合成，是有效的血管擴張和血小板抑制因子。eNOS在分泌期子宮內膜腺上皮和微血管內皮中表達[6]。iNOS在人月經周期的分泌晚期和月經開始時的子宮內膜上皮細胞、免疫活性細胞和蛻膜基質細胞中表達，高濃度時可合成NO，并且具有前炎癥反應的特點，是支持和維持蛻膜過程必需的因子。eNOS和iNOS在著床期發生上調[7]。另外，eNOS在著床位點錨定的絨毛細胞和滋養層細胞中的表達顯著升高，在合體滋養層也有表達，說明eNOS對著床和血管侵入過程也起一定的作用。本試驗通過抑制附植期NO的形成，使得子宮平滑肌明顯緊縮、子宮血管的通透性也顯著降低，提示NO可能通過對血管的通透性的調節來影響子宮內膜的脫膜化過程。

胚胎植入受一系列復雜因素的嚴格調控，胚胎成功植入需要各種因子之間的協調作用。胚胎植入過程中一個最突出的現象是子宮內膜ECM成分的重組和更新。研究表明，MMPs是胚胎植入過程中降解ECM的主要酶，其蛋白表達與胚胎滋養層細胞的最大侵入能力相吻合，是構成胚胎侵入能力的主要因素[8]。丁雋等[9]應用基質金屬蛋白酶抑制劑（l，l0一菲羅啉）作用于妊娠大鼠造成流產的模型，以驗證基質金屬蛋白酶在正常妊娠中的作用時發現，基質金屬蛋白酶抑制劑在妊娠期抑制MMPs的表達，使MMPs的分泌不足，導致流產或胎鼠宮內生長遲緩，說明了MMPs在胎盤滋養細胞浸潤和妊娠的維持中具有重要作用。目前，對于NO調節子宮MMP-9基因轉錄水平的分子機制尚不清楚，這還有待于進一步研究。

[1]Shakarjian M P,Bhatt P,Gordon MK,et al.Preferential expression of matrix metalloproteinase-9 in mouse skin after sulfur mustard exposure[J].Appl Toxicol,2006,26（3）:39-46.

[2]VandenSteen P E,Aelst.V,Starckx S,et al.Matrix metalloproteinases,tissue inhibitors of MMPs and TACE in experimental cerebralmalaria[J].Lab Invest2006,86（9）:873-888.

[3]Ogando D,Cella M,Ribeiro ML,et al.IL-10 inhibits nitric oxide synthesis in murine uterus[J].Neuroimmunomodulation,2004,11（2）:127-132.

[4]蔡理全,曹宇靜,段恩奎.整合素áVa3在小鼠胚胎植入中的作用[J].科學通報,2000,45（15）:1639-1644.

[5]沈政,趙興緒.cGMP參與NO對小鼠胚泡黏附擴展及MMP-2分泌的調節[J].科學通報，2004，49（8）:35-38.

[6]Schmidt D,Asmis L,Odermatt B,et al.Engineered living blood vessels:functional endothelia generated from human umbilical cord-derived progenitors[J].hum reproduction,2006，82（4）:1465-1471.

[7]Chwalisz K,Garfield R.Role of nitrie oxide in implantation and menstruation[J].Hum Reprod，2000,15（3）:96-111.

[8]Huppertz B,Kertschanska S,Demir A Y,et al.Immunohistochemistry of matrix metallopr-oteinases（MMP）,their substrates,and their inhibitors（TIMP）during trophoblastinvasion in the human placenta[J].Cell Tissue Res,1998,291（1）:133-148.

[9]丁雋，潘振業.基質金屬蛋白酶抑制劑引起大鼠流產的實驗模型[J].中國比較醫學雜志，2005，（5）:236.