膈下逐瘀湯對(duì)大鼠纖維化肝組織CTGFmRNA和PDGF-A蛋白表達(dá)的影響①

吳琦 劉哲丞 齊曉丹 張英博

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生化教研室; 2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院; 3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

膈下逐瘀湯對(duì)大鼠纖維化肝組織CTGFmRNA和PDGF-A蛋白表達(dá)的影響①

吳琦1劉哲丞2齊曉丹1張英博3

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生化教研室; 2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院; 3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 觀察膈下逐瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠肝臟組織結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor, CTGF)mRNA和血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet_derived growth factor, PDGF)-A蛋白表達(dá)的影響。方法 Sprague-Dawley(SD)大鼠60只隨機(jī)分為空白對(duì)照組(n=20)、模型對(duì)照組(n=20)和膈下逐瘀湯組(n=20),共3組。用40%四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)復(fù)制大鼠肝纖維化模型,膈下逐瘀湯干預(yù)12周后處死大鼠。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)大鼠肝組織CTGF mRNA的表達(dá),免疫組化染色法檢測(cè)PDGF-A蛋白表達(dá)。結(jié)果模型組CTGF mRNA 2-ΔΔCt值(3.59±0.52)和PDGF-A積分光密度(IOD)值(23.38±1.55),顯著高于正常對(duì)照組(分別為1.02±0.23和15.02±1.34)(P<0.05),表明模型組CTGF mRNA和PDGF-A蛋白表達(dá)上調(diào)。與模型組比較,膈下逐瘀湯組CTGF mRNA 2-ΔΔCt值(1.62±0.25)和PDGF-A IOD值(18.04±0.83)顯著降低(P<0.05),表明CTGF mRNA表達(dá)下調(diào)。結(jié)論 膈下逐瘀湯可能通過(guò)下調(diào)CTGF mRNA和PDGF-A蛋白的表達(dá)而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

膈下逐瘀湯 肝纖維化 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子 血小板衍生生長(zhǎng)因子

肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理基礎(chǔ),也是進(jìn)一步向肝硬化發(fā)展的中間環(huán)節(jié)[1]。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種重要的促纖維化細(xì)胞因子,不僅可以直接刺激成纖維細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)合成,還可以專一介導(dǎo)化生長(zhǎng)因子-β(transforma-tion growth factor beta,TGF-β)的促纖維化作用,其異常表達(dá)在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[2]。血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet_derived growth factor,PDGF)是結(jié)締組織來(lái)源細(xì)胞的主要有絲分裂原,可調(diào)控成纖維細(xì)胞的分化增殖,具有誘導(dǎo)膠原和其他細(xì)胞外基質(zhì)成分合成的功能。有研究表明,PDGF與組織纖維化的關(guān)系密切[3]。中藥復(fù)方的作用特點(diǎn)是多種成分和多個(gè)靶點(diǎn)的整體調(diào)節(jié),在防治肝纖維化的效果上往往明顯優(yōu)于單味藥物或單一成分。膈下逐瘀湯作為治療膈下瘀血證的代表方劑,對(duì)肝纖維化的預(yù)防、治療具有良好臨床基礎(chǔ)[4]。因此,本課題組利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化技術(shù),觀察了膈下逐瘀湯對(duì)大鼠肝纖維化肝組織中CTGFmRNA和PDGF-A蛋白表達(dá)的影響,旨在探討膈下逐瘀湯防治肝纖維化的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 藥物 膈下逐瘀湯取自《醫(yī)林改錯(cuò)》原方。由五當(dāng)歸9g、靈脂6g、紅花9g、桃仁9g、川芎6g、烏藥6g、丹皮6g、赤芍6g、甘草9g、延胡索3g、枳殼5g、香附5g組成。方藥按傳統(tǒng)水煎成劑并濃縮,4℃冰箱保存。四氯化碳(CCl4分析純,北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性SD大鼠60只,清潔級(jí),體重(200±10)g,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)買,許可證編號(hào)SCXK(京)2002-0003。將SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、肝纖維化模型組和膈下逐瘀湯組共3組。

1.1.3 儀器及試劑 2700型PCR System擴(kuò)增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品,UV-2550型紫外分光光度計(jì)為日本島津產(chǎn)品,ABI 7300熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。RNA抽提試劑RNAiso和SYBR(r)ExScript(tm)RT-PCR試劑盒購(gòu)自TAKARA公司。引物由TAKARA公司設(shè)計(jì)和合成,其序列如下:GAPDH引物序列:forward 5′-GACAACTTTGGCATCGTG-GA-3′;reverse 5′-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3′。CTGF引物序列:CTGF引物序列:forward,5′-CACCCGGGTTACCAATGACAA-3′;reverse,5′-AGCCCGGTAGGTCTTCACAC-TG-3′;Rabbit Anti-PDGF-A和SABC免疫組化染色試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。DAB顯色試劑盒為福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 肝纖維化模型的建立[5]和藥物干預(yù) 模型組用40%CCl4(精制橄欖油配制)皮下注射法,劑量為2mL/kg體重,每周2次,共12周?？瞻讓?duì)照組以生理鹽水代替CCl4皮下注射,膈下逐瘀湯組按7.0g·kg-1·d-1灌胃給予膈下逐瘀湯,每天1次,連續(xù)12周?？瞻讓?duì)照組和模型組給予等體積蒸餾水,給藥方法同模型組。

1.2.2 大鼠肝臟組織CTGF mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 治療結(jié)束后第2天,每組隨機(jī)取5只大鼠,戊巴比妥鈉麻醉取肝臟后處死。用RNAiso Reagent(TaKaRa公司)提取肝組織總RNA,利用紫外分光光度分析及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的含量、純度及完整性。按SYBR(r)ExScript(tm)RT-PCR試劑盒方法將肝組織RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,cDNA中取1個(gè)樣本進(jìn)行梯度稀釋作為繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣本,與其余樣本同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)采用SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time)kit試劑,反應(yīng)體系為20μL。熱循環(huán):95℃預(yù)變性10s,共1個(gè)循環(huán)。95℃變性5s,60℃退火31s,40個(gè)循環(huán)。分別擴(kuò)增GAPGH和CTGF,每個(gè)樣本作2個(gè)復(fù)孔,獲得到2組Ct平均值。用基于2-△△Ct方法進(jìn)行相對(duì)定量分析[6]。△△Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對(duì)照組。

1.2.3 大鼠肝組織PDGF-A蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測(cè) 治療結(jié)束后第2d,每組都隨機(jī)選出6只大鼠取肝組織,用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片。采用SABC法進(jìn)行免疫組化染色,石蠟切片脫蠟水化,經(jīng)0.3%H2O2室溫25min滅活內(nèi)源性酶,微波爐加熱抗原修復(fù)。用5%BSA封閉液室溫封閉20min,加PDGF-A抗體4℃冰箱過(guò)夜,滴加生物素化山羊抗兔IgG 37℃ 20min,滴加試劑SABC 37℃ 20min,以上各步驟間均用0.02M PBS漂洗3次,DAB顯色后蘇木精淡染胞核,常規(guī)脫水、透明、封片,光鏡下觀察,棕色著色處為陽(yáng)性,對(duì)照組用未免疫的兔血清代替一抗,其他步驟相同。采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng),對(duì)每個(gè)統(tǒng)計(jì)場(chǎng)PDGF-A陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度(IOD)進(jìn)行測(cè)量。

圖1 各組樣本CTGF mRNA的擴(kuò)增曲線(A.空白對(duì)照組;B.模型對(duì)照組;C.治療組)

2 結(jié)果

2.1 膈下逐瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠肝臟組織CTGF mRNA表達(dá)的影響(圖1和表1)

2.2 膈下逐瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠肝組織PDGF-A蛋白的影響

各組大鼠肝組織均見(jiàn)PDGF-A陽(yáng)性細(xì)胞(圖2),通過(guò)Motic Med 6.0 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析各組IOD(圖3)。

3 討論

慢性肝病在我國(guó)的發(fā)病率很高,日益威脅我國(guó)人民的健康,其中肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的共同途徑。在對(duì)慢性乙型肝炎等原發(fā)疾病尚無(wú)有效病因治療方法的情況下,減緩或阻止肝纖維化進(jìn)程是很重要的治療對(duì)策。肝纖維化屬中醫(yī)“積聚”范疇,中醫(yī)藥在防治肝纖維化方面積累了大量的臨床經(jīng)驗(yàn),利用中藥多成分和多靶點(diǎn)的特點(diǎn),從療效確切的藥方中尋找新的治療效果好、毒副作用較小的抗肝纖維化藥物,是我們國(guó)家創(chuàng)制自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)新藥物的捷徑。膈下逐瘀湯出自清代醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》,臨床應(yīng)用比較廣泛,對(duì)肝纖維化的治療有良好的效果。

目前認(rèn)為,肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的,在纖維化過(guò)程中肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)活化起著重要的作用,而HSC活化主要涉及一系列細(xì)胞因子的作用[7]。其中PDGF是目前已知的HSC最強(qiáng)絲裂原,也是HSC遷移最有力的促進(jìn)因子,對(duì)HSC的活化、增殖和遷移均有明顯的促進(jìn)作用。PDGF能夠促進(jìn)活化HSC產(chǎn)生膠原,尤其是Ⅰ型和Ⅲ性膠原,PDGF還可以抑制膠原酶活性,減少細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的降解[8]。在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中,PDGF的表達(dá)明顯高于正常肝組織,其活性隨肝纖維化程度加重而升高,尤其在肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)內(nèi)的表達(dá)量與肝纖維化程度呈顯著正相關(guān)[9]。CTGF為PDGF的下游因子,是一種富含半胱氨酸的多肽,其主要生物學(xué)效應(yīng)為促進(jìn)細(xì)胞增殖,參與細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程和ECM的產(chǎn)生,誘導(dǎo)黏附、參與組織的創(chuàng)傷修復(fù)。在正常狀態(tài)下表達(dá)水平很低,且其作用限于結(jié)締組織,因此,阻斷CTGF表達(dá)或抑制其活性,將有望成為一種更特異、更有效的長(zhǎng)期防治肝纖維化的手段[10]。

圖2 各組PGGF-A免疫陽(yáng)性細(xì)胞IOD照片(A. 正常對(duì)照組;B.模型對(duì)照組;C.中藥組)

圖3 各組大鼠肝臟組織;PDGF-A表達(dá)水平比較(n=6)

表1 各組大鼠肝臟組織CTGF基因表達(dá)相對(duì)值比較(,n=5)

表1 各組大鼠肝臟組織CTGF基因表達(dá)相對(duì)值比較(,n=5)

注:與模型對(duì)照組比較,*P＜0.05

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本課題組分別采用SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)定量RT-PCR法和免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)各組大鼠肝組織CTGFmRNA和PDGF-A的表達(dá),結(jié)果顯示,各組均有CTGF mRNA和PDGF-A的表達(dá)。模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比CTGF mRNA和PDGF-A的表達(dá)顯著增加;膈下逐瘀湯干預(yù)組與模型對(duì)照組相比CTGF mRNA和PDGF-A的表達(dá)則降低,因此,我們認(rèn)為膈下逐瘀湯可調(diào)控肝組織CTGF mRNA和PDGF-A蛋白分子的表達(dá),從而延緩甚至抑制肝纖維化的進(jìn)程。

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R243:Q7

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1674-0742(2010)08(c)-0029-04

吳琦(1975～):男,黑龍江齊齊哈爾人,碩士,講師,齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,研究方向:分子生物學(xué)。

劉哲丞(1980～):男,黑龍江齊齊哈爾人,本科,助理實(shí)驗(yàn)師,齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室,研究方向:生物化學(xué)。

齊曉丹(1981～):黑龍江齊齊哈爾人,研究生,助教,齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,研究方向:分子生物學(xué)。

張英博(1973～):男,黑龍江齊齊哈爾人,研究生,副研究員,高級(jí)實(shí)驗(yàn)師,齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室,研究方向:中醫(yī)中藥。

2010-06-08