噬菌體檢測食源性致病菌的研究進展

李 萌，王靜雪*，林 洪

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

噬菌體檢測食源性致病菌的研究進展

李 萌，王靜雪*，林 洪

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

食源性致病菌是影響食品安全的主要因素之一。傳統的檢測手段已經不能滿足食品安全快速檢測的要求，食源性致病菌的檢測技術面臨著由耗時、費力的傳統方法向省時、簡便的現代檢測技術轉變的挑戰。噬菌體作為細菌的天敵，具有結構簡單、專一性強、分布廣泛、繁殖速度快的特點。現今已有很多噬菌體檢測食源性致病菌的方法，這些方法方便、快速、高度特異性，特別是當檢測費用成為重要的考慮因素時，更有優勢。本文對噬菌體檢測食源性致病菌的技術原理及其應用進行分類綜述和分析。

噬菌體；致病菌；檢測方法

食源性疾病是人體攝入致病微生物、毒素或化學物質污染的食品而引起感染性或中毒性癥狀的疾病。大量的食源性疾病都是由致病性微生物引起，其臨床表現為惡心、嘔吐、痙攣、腹痛和腹瀉等。常見的食源性致病菌有沙門氏菌(S a l m o n e l l a)、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、大腸桿菌O157:H7 (Escherichia coli O157:H7)、志賀氏菌(Shigella)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。食源性致病菌是影響食品安全的主要因素之一。在世界醫藥和公共衛生領域內，需要建立快速、靈敏以及精確的方法來檢測食源性致病菌。傳統的增菌培養、生理生化鑒定等技術手段已經滿足不了食品安全快速檢測的要求，食源性致病菌的檢測技術面臨著由耗時費力的傳統方法向省時簡便的現代檢測技術轉變的挑戰。

目前食源性致病菌的快速檢測多采用免疫學、分子生物學等技術實現食源性致病菌的快速檢測。免疫學檢測方法是以抗原與抗體的特異性反應為基礎建立的，如酶聯免疫吸附法(ELISA)方法簡便，但是靈敏度和特異性有待提高，而且在有些情況下結果不能夠被培養實驗驗證[1]；分子生物學法，如依賴DNA體外擴增原理的DNA指紋圖譜技術、多重PCR檢測技術、實時定量PCR等檢測技術具有較高的檢測靈敏度，但是儀器和試劑盒成本昂貴，對操作技術要求高；基因芯片技術利用相關細菌的特異性基因(如毒力基因、抗生素耐受基因)和基因庫中的rDNA序列設計玻片上的片段可快速、準確地檢測和鑒定食品中的病原菌，但是該方法也有一定的缺點，如背景干擾比較大、從不同細菌中分離出來的RNA的完整性不同、實驗室費用高等；蛋白質芯片技術能滿足食品致病菌檢測快速、準確度高的要求，但是芯片

的制作仍是一項還不完全成熟的技術。以上這些現代化檢測方法不同程度地改進了傳統方法檢測成本高、速度慢、效率低、盲目性等缺點，但或多或少都存在不足之處。隨著生物、化學以及計算機技術的進步，噬菌體檢測致病菌的方法以其獨特的優點，吸引了越來越多科學家的研究興趣，本文就噬菌體檢測食源性致病菌的研究進展進行總結。

1 噬菌體簡介

噬菌體(bacteriophage或phage)是一類感染細菌的病毒，主要由核酸和蛋白質外殼組成，可以通過蛋白質外殼與宿主菌表面的受體特異性結合，將其遺傳物質DNA或RNA注入宿主菌體內。最簡單的噬菌體只有10多個基因，最復雜的噬菌體有數百個基因。凡是有細菌的地方，就可能有相應噬菌體的存在。據估計，自然界中細菌的數量大約為1030個，假如每個細菌有10種對應的噬菌體，那么噬菌體的數量將達到1031個之巨[2]。

圖1 噬菌體的繁殖途徑Fig.1 Propagation styles of bacteriophage

噬菌體的繁殖一般分為5個階段，即吸附、侵入、增殖、裝配和裂解。凡在短時間內能夠連續完成以上5個階段而實現其繁殖的噬菌體，稱為烈性噬菌體(virulent phage)，反之則稱為溫和噬菌體(temperate phage)。烈性噬菌體感染細胞后可立即在宿主細胞內開始自身的生命循環，引起細菌細胞的裂解，而且具有廣譜的裂解宿主性(圖1中步驟(1)至(7)所示)。溫和型噬菌體感染細胞后有2條途徑：一是裂解途徑(l y t i c c y c l e)，這與烈性噬菌體一樣；另一條是溶源途徑(lysogenic cycle)。溶源途徑噬菌體能夠將自身的DNA整合到宿主的核染色體組上，并可長期隨宿主DNA的復制而進行同步復制，因此不引起宿主細胞裂解，反而會導致宿主細菌表型的改變甚至增強細菌的致病性。鑒于噬菌體結構簡單、寄主專一性很強，只能感染特定的菌種或菌株、分布廣泛、繁殖速度快的特點，現今已有很多噬菌體快速檢測食源性致病菌的方法[3]。基于噬菌體途徑的檢測方法，可提供方便、快速、高度特異性的選擇，特別是當檢測費用成為最重要的考慮因素時，更有優勢。

2 噬菌體檢測方法

噬菌體檢測方法按照不同的原理主要可分為4種：1)傳統的噬菌體檢測方法是基于烈性噬菌體快速裂解宿主菌并形成直觀清晰的噬菌斑的原理，主要是噬菌體分型法和噬菌體擴展法；2)與生物傳感器的聯用技術，如電阻抗法、電化學方法；3)采用先進的生物或化學試劑進行檢測工作，如生物發光法和熒光標記法；4)應用分子生物學技術構建報告噬菌體用于檢測食源性致病菌。

2.1 傳統的噬菌體檢測方法

烈性噬菌體能夠高度專一的裂解特異性宿主細菌，并在培養基上形成肉眼清晰可見的噬菌斑，根據噬菌斑的有無、多少、清晰程度、形態來判定宿主細菌的種類和數目。由此形成的噬菌體檢測方法主要包括噬菌體分型技術和噬菌體擴增法。

2.1.1 噬菌體分型技術

細菌分型方法有血清學分型、噬菌體分型、質粒指紋圖譜分析(P P A)、限制性酶切片段長度多態性(RFLP)、隨機擴增多態性DNA(RAPD)、擴增片段長度多態性(AFLP)、多位點序列分型(MLST)等[3]。噬菌體分型作為一種常用的傳統細菌分型方法，能夠方便的區分細菌不同血清型，在流行病學的研究中得到應用。噬菌體分型與常規生化實驗法的檢出率在統計學上無顯著差異，且相對生化實驗可縮短時間，僅需2d[4]。研究表明，兩種或多種分型技術的聯合使用，將使分型研究向更快更準的方向發展，如Grif等[5]利用5種不同的分型方法對E.coli O157進行實驗，發現任何單一的分型鑒定都難以滿足流行病動力學的調查分析，多種分型方法聯合使用才能得到精確的鑒定結果。因此，盡管有更為先進的分子分型技術手段，但操作簡單、廉價、省時的噬菌體分型技術仍是一種重要和有效的方法。

國內外已有針對噬菌體分型方法用于致病菌檢測的標準步驟，國內《霍亂防治手冊》詳細說明了利用霍亂噬菌體分型技術鑒定細菌的方法步驟[6]。噬菌體分型時，實驗室必須配備一整套分型所用的噬菌體以及對照株，現已有沙門氏菌、大腸桿菌、李斯特菌和彎曲桿菌等食源性致病菌較為完整的噬菌體分型體系，按照標準步驟可完成相應宿主細菌的檢測工作[7-10]。但該實驗方法結果差異較大，且有些菌株尚不能用該法進行有效分型，局限了該方法的廣泛應用。

2.1.2 噬菌體擴展法

烈性噬菌體感染宿主菌后短時間內會引起細胞的裂解而在雙層平板中形成明顯的噬菌斑，因此根據噬菌斑的數目檢測樣品中病原菌的含量。但是當樣品中的待檢細菌數目較少時，將不利于噬菌斑的形成，影響檢測結果。針對這一問題主要有兩種解決途徑：1)先使用免

疫磁性分離法(IMS)進行待檢菌體的富集，再進行噬菌體裂解宿主菌；2)Rees等[11]采用噬菌體擴增法，利用輔助菌配合噬菌體對細菌的裂解以及噬菌斑的形成。

噬菌體擴增法主要步驟如圖2所示：1)將待檢細菌的噬菌體與樣品混合，由于噬菌體高度的專一性，僅待檢細菌被噬菌體吸附侵染；2)加入滅病毒劑，滅活所有游離的噬菌體；3)中和滅病毒劑，將輔助菌加入到樣品中，并立刻混合后倒入雙層平板進行培養；4)釋放出來的子代噬菌體裂解輔助菌；5)平板中形成清晰可見的噬菌斑。該方法中由于輔助菌也能夠被噬菌體裂解，因此被侵染的待檢細菌裂解釋放出來的子代噬菌體會立刻吸附裂解輔助菌從而形成清晰的噬菌斑。該方法的關鍵是選擇合適的滅病毒劑，其中化學試劑硫酸亞鐵銨(FAS)最為常用，另外植物提取物如茶提取物、番石榴提取物等也可以作為滅病毒劑[12-13]。噬菌體擴增法簡單、檢測速度快、成本合理且檢測限較低，如Stewart等[14]利用該方法在4h內成功檢測出樣品中的600CFU/mL的沙門氏菌以及40CFU/mL的銅綠假單胞桿菌。利用該法已成功的檢測出結核桿菌、沙門氏菌、李斯特菌、大腸桿菌、綠膿假單胞菌和彎曲桿菌等[15-16]，但是該法的缺點是對檢測應用有較高的條件選擇，如噬菌體濃度與感染時間、滅病毒劑滅活時間、輔導菌的篩選等。

圖2 噬菌體擴展法檢測食源性致病菌的具體步驟Fig. 2 Specific steps for detecting foodborne pathogenic bacteria by phage-based methods

2.2 與生物傳感器技術聯用的噬菌體檢測方法

生物傳感器(biosensor)是一種獨立的、完整的分析裝置，由固定化并具有化學分子識別功能的生物材料、換能器件及信號放大裝置構成。其工作原理是待檢測物質與生物活性材料發生生物學反應，產生的信號由換能器轉換成可定量和可處理的電信號，經二次儀表放大輸出，最終獲得待檢物濃度的信息。將噬菌體與生物傳感器技術結合使用的主要原理是具有專一裂解特點的烈性噬菌體能夠將特異性的細菌裂解釋放出胞內物質，通過生物傳感器監控細菌某種胞內物質的信號變化，檢測出致病菌。

2.2.1 應用電阻抗法檢測食源性致病菌

電阻抗法的原理是細菌在培養基內生長繁殖的過程中，會將大分子電惰性物質如碳水化合物、蛋白質和脂類等轉化成具有電活性的小分子物質，如乳酸鹽、醋酸鹽等這些離子態物質能增加培養基的導電性，使培養基的阻抗發生變化，因此可以通過檢測培養基的電阻抗變化情況來判定細菌的生長繁殖特性[17]。

阻抗法應用于食品檢測操作時，首先將相應培養基置于有一對不銹鋼電極的容器內，然后接種經過處理的樣品，在一定的溫度條件下培養，利用電子分析儀器檢測培養基中的阻抗變化，并建立阻抗變化時間與常規檢測方法之間的參數關系，從而實現對微生物生長代謝的快速監測。利用電阻抗法檢測樣品中病原菌有兩種途徑：第一種途徑使用選擇性增強培養基，僅待檢的病原菌在培養基中生長繁殖，其他雜菌的生長被抑制，通過觀察電阻抗的變化情況，就可得到監測結果[18]；該方法對培養基要求嚴格，在實際操作過程中常會因為培養基的選擇性不強造成假陽性的結果；第二種途徑利用專一性噬菌體裂解樣品中的目標致病菌，致病菌的生長被抑制，觀察電阻抗的變化情況，判定樣品中的致病菌，該方法使得檢測的特異性和準確性大大增強。Chang等[19]利用此法，將專一性噬菌體AR1作用于E.coil O157:H7，根據阻抗變化時間(DT)成功檢測出大腸桿菌。

同傳統方法相比，利用阻抗法可快速監測食品中的微生物污染，絕大部分可在24h內鑒定出微生物污染，而令人關注的高度污染樣品則可更早檢出；但并不是所有的細菌都能夠代謝產生電活性的小分子物質，因此限制了電阻抗法的應用。為了打破該局限，Silley等[20]通過監測細菌代謝產生的CO2而不是電活性物質檢測出樣品中的致病菌。通過改造的電阻抗法已被成功的用于葡萄球菌、李斯特菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、綠膿桿菌、嗜水氣單胞菌、沙門氏菌和空腸彎曲菌的檢測[21-22]。

2.2.2 應用電化學方法檢測食源性致病菌

N e u f e l d等[23]描述了利用新型電化學方法(electrochemical method)快速鑒定和定量分析病原細菌。這個系統利用噬菌體對于宿主細菌的特異性，在混合的細菌菌群中專一性的裂解特異性的宿主細菌，從而釋放出該細菌的胞內酶類，而胞內酶類可以通過安培計測量來監測。在模式系統中，利用大腸桿菌專一性的烈性噬菌體(帶有β-D-半乳糖苷酶活性作為標記)，可以在6～8h內檢測出1CFU/100mL的大腸桿菌。理論上，這種電化學方法可以運用到任何噬菌體和細菌組合中，通過監測專一性噬菌體裂解生長釋放的酶標記，就可得到檢測結果。

與生物傳感器聯用的噬菌體檢測技術操作簡單、分析速度快，但由于生物傳感器抗干擾能力差、可靠性低，限制了生物傳感器在病原體檢測中的應用，現今尚無可靠的商業化傳感器走向市場，因此影響了該噬菌

體檢測技術的推廣和應用。

2.3 采用生物或化學發光試劑進行噬菌體檢測

2.3.1 應用 ATP生物發光法檢測食源性致病菌

三磷酸腺苷(ATP)是微生物不可缺少的，廣泛存在于生物體內的一種能量物質，能夠在真核生物luc基因編碼的螢火蟲熒光素酶的作用下發光。國外對于ATP及生物發光現象的研究較早，Strehler等[24]首先提出了基于ATP 的生物發光反應機理：

一般情況下，烈性噬菌體裂解宿主菌細胞壁，將宿主菌的胞內物質如ATP、腺苷酸激酶(AK)等釋放出來。噬菌體介導的生物發光法就是利用噬菌體裂解細菌釋放出胞內物質ATP，使用熒光素酶可使ATP釋放出能量，這些能量產生熒光的強度就代表ATP的量，從而推斷出菌落總數。1995，年Sanders[25]利用該方法檢測出樣品中的李斯特菌，但是由于食品或者環境樣品中本底ATP值的影響，導致檢測限較高。1998年，Blasco等[26]根據AK可催化二磷酸腺苷(ADP)轉化成ATP的原理，向樣品中加入ADP，噬菌體裂解細菌后釋放出來的AK將ADP轉化成ATP從而提高了樣品發光強度，能夠在1h之內檢測出低于103CFU/mL的大腸桿菌(圖3)。利用噬菌體介導的ATP生物發光法能夠成功的檢測出芽孢桿菌、彎曲桿菌、大腸桿菌、李斯特菌、假單胞菌、沙門氏菌等[27-30]。

圖3 AK/ATP生物發光檢測法Fig.3 AK/ATP bioluminescence assay

一般ATP生物發光法檢測限為103CFU/mL，為了降低檢測限，Squirrell等[31]將噬菌體介導的ATP生物發光技術和IMS法聯用能夠在5min～1h內檢測出樣品中102CFU/mL的E.coli O157。此外聯用技術還能夠同時檢測樣品中多種致病菌[32]，具有更廣泛的應用意義。

2.3.2 采用NADH生物發光法檢測食源性致病菌

還原性輔酶酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)廣泛存在于一切動物、植物和微生物的活細胞中，是細胞能量代謝所必須的輔酶。在特定代謝時期的微生物細胞中的NADH含量是相對穩定的，其含量與食品中微生物的數量存在成正相關性，而細菌死亡后，在胞內酶作用下，NADH將很快被分解。由此可通過檢測NADH的含量推算出活菌數目。NADH可在FMN-NADH氧化還原酶和發光細菌lux基因編碼的熒光素酶作用下發光，生物發光機理如下：

利用噬菌體介導的NADH生物發光法檢測方法原理與ATP生物發光法類似，利用烈性噬菌體裂解宿主細菌，釋放出胞內的NADH，NADH在FMN-NADH氧化還原酶和熒光素酶作用下發光，通過測定熒光強度，推算出菌落總數。Mei等[33]利用噬菌體介導的NADH生物發光法成功的檢測出克雷伯氏菌，該檢測方法操作簡單、廉價、省時。

ATP/NADH生物發光法因為無需培養，操作快速簡單，具有高靈敏度以及相對可行性(菌落總數與發光值呈顯著相關)和可擴展性(食品、食品生產設備和清潔設備[34]及環境樣品檢測)等優點，目前已廣泛用于致病菌的檢測。但是該方法也有缺點，如需要專門的檢測儀、細胞發光強度本質差異較大、檢測期間發光自然變化幅度較寬、重現性不佳、誤差較大等。

2.3.3 應用熒光標記噬菌體法檢測食源性致病菌

熒光標記檢測技術是指利用熒光染料共價結合或物理吸附在某個基團上，利用它的熒光特性來檢測病原菌的方法，因檢測快速、直觀、敏感性高而倍受青睞。常用的傳統熒光染料有熒光素類和羅丹明類，隨著科技的發展，由試劑公司開發的商業化熒光試劑如YOYO、SYTO、SYBR GreenI等在很大程度上代替了傳統的熒光染料。Goodridge等[35]報道了發展免疫親和磁分離噬菌體評估技術用以檢測大腸桿菌。通過核酸染料YOYO-1制備熒光噬菌體LG1，如圖4所示，熒光噬菌體LG1吸附至宿主菌E.coli O157:H7上，可觀察到噬菌體在細菌周圍形成光環。當與大腸桿菌O157特異性的免疫親和磁珠結合之后，熒光噬菌體LG1就附著在磁珠上了。利用熒光顯微鏡、流式細胞儀、掃描電子顯微鏡都可以檢測。該方法可以從經過10h富集培養后的絞細牛肉和

鮮奶中檢測到100CFU/mL的大腸桿菌[36-37]。國內有研究通過核酸熒光染料SYBRRgold標記O-I噬菌體侵染沙門氏菌，熒光顯微鏡鑒定結果顯示能檢測到低于100CFU/mL的沙門氏菌[38]。

用于生物熒光標記的發光材料越來越多，除了上述提及的商業化熒光試劑外，具有較高發光效率、巰基羧酸修飾的納米微粒，如CdSe、CdTe 等半導體量子點(quantum dots，QDs)已成為科學界的研究熱點。量子點具有高熒光強度、強抗光漂白能力和窄發射光譜等獨特的光學特性。與傳統商業化熒光試劑相比，量子點納米材料在光穩定性、顏色多樣性、激發譜范圍、發色譜范圍、熒光壽命、生物相容性和儀器要求等7個方面具有優越性。量子點標記檢測法靈敏度高、特異性強，具有較短的操作時間，且不易受樣品基質影響的特點。利用QDs標記噬菌體技術能夠成功檢測出樣品中低于10CFU/mL的大腸桿菌[39]。

熒光標記能夠實現食品中致病菌大量、快速、準確而直觀的檢測，且有很強的優勢，但所選用的噬菌體只能針對特定的細菌種，以致檢測目標相對單一，且標記染料價格昂貴，推廣應用時受到限制。

2.4 應用報告噬菌體法檢測食源性致病菌

圖4 熒光噬菌體LG1吸附至E.coliO157:H7Fig.4 Adsorption of fluorescent phage LG1 toE. coliO157: H7

圖5 報告噬菌體檢測方法Fig.5 Reported phage-based detection methods

目前噬菌體已被廣泛應用于遺傳工程中的外源基因克隆和表達的載體，常用的效果最好的報告基因(rep)有細菌熒光素酶基因(lux)、綠色熒光蛋白基因(gfp)、冰核蛋白基因(ina)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)。報告噬菌體檢測技術中，一個報告基因通過噬菌體插入到目標菌體的DNA中，隨著報告基因的表達，目標菌體便可快速得到檢測(圖5)。數據顯示，報告噬菌體已成功的用于檢測很多食源性致病菌，如沙門氏菌、大腸桿菌等(表1)。

表1 報告噬菌體的應用Table 1 Current application of phages

2.4.1 細菌熒光素酶基因(lux)

細菌熒光素酶發光大致歷程如下：

由于報告噬菌體不具有細胞的代謝活動，無法合成發光反應所必須的熒光素酶、底物和能量，因此噬菌體在細胞體外不發光，但是當帶有發光基因的噬菌體吸附侵染宿主細菌后，發光基因得以表達，細菌的代謝活動產生發光反應所必須的物質，因此，噬菌體在宿主細胞體內可以發光。由于噬菌體繁殖速度快，因此大大地增強了發光的靈敏性和速度。Waddell等[42]利用溶源性大腸桿菌噬菌體Φ v10引入luxAB基因，用于檢測E.coli O157:H7。P22噬菌體為鼠傷寒沙門氏菌噬菌體，該噬菌體引入luxAB基因后，可以在16h內檢測出樣品中的鼠傷寒沙門氏菌。

2.4.2 綠色熒光蛋白基因(gfp)

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是一種生物發光蛋白，分子質量為27kD，具有238個氨基酸，其內源熒光基因在受到紫外光或藍光激發時可高效發射出清晰可見的綠光，gfp基因與其他報告基因不同，處在于無需再加任何底物和輔助因子即可構成熒光檢測系統。Oda等[51]報道應用GFP標記T2類噬菌體來檢測大腸桿菌O157:H7。這種標記后的噬菌體不能夠與大腸桿菌K-12菌株結合，顯示該方法的特異性。

2.4.3 冰核蛋白基因(ina)

利用冰核基因報告噬菌體檢測致病菌的方法被稱作細菌冰核法。冰核基因能夠使沒有成冰核能力的細菌具有成冰核能力，這是細菌冰核法檢測的基礎。冰核基因與通常的報告基因不同處在于它對于信號的檢測不是由于酶的催化反應，而是一種物理過程(水的液-固狀態的改變)。1990年，Wolber等[44]首次利用沙門氏菌噬菌體P22引入ina基因，使ina基因能夠在沙門氏菌體內表達冰核蛋白發生冰核現象，通過熒光冷凍指示染料很容易檢測出樣品中的沙門氏菌，且檢出限低(10CFU/mL)。實驗還顯示，高濃度的雜菌存在也不影響檢測結果，因此操作過程中不需要進行目標菌種的富集；Irwin等[52]將BIND法和IMS法聯用檢測樣品中的沙門氏菌，能夠將檢出限降低到5CFU/mL。

2.4.4 β-半乳糖苷酶基因(lacZ)

目前人們研究最多的編碼β-半乳糖苷酶的基因(lacZ基因)來自于E.coli。作為報告基因分子，lacZ常與熒光素酶聯用，作為lux報告基因檢測的內參物，消除因為質粒的轉染效率不同而帶來的誤差。Goodrigde[43]利用lacZ報告噬菌體成功檢測出樣品中的O157:H7，且檢測限僅為102CFU/mL。然后，研究人員將最大概率數(most probable number，MPN)法應用到食源性病原菌檢測中，檢測水平可降低到10CFU/mL，檢測時間僅為1h。

報告噬菌體技術耗時少、耗能低、精密度高，但目前為止這一技術還未被廣泛應用。主要歸于兩方面原因：第一，噬菌體遺傳學特性研究的不夠清晰，很難對其進行遺傳學改造；噬菌體專一性導致其無法滿足檢測一個細菌中所有血清型的要求；第二，法律法規方面對于轉基因技術的嚴格要求也限制了該技術的應用。但是隨著生物學方面的問題不斷得到解答，科研的進一步深入，報告噬菌體無疑將成為一種重要的病原菌檢測工具。

2.5 其他方法

Madonna等[53]將質譜技術與噬菌體聯用檢測致病菌，先使用IMS進行樣品中大腸桿菌的濃縮、選擇性分離，再向樣品中加入專一性噬菌體，利用基質輔助激光解吸電離質譜(MALDI-MS)方法監控樣品中噬菌體衣殼蛋白信號的變化，從而在2h內檢測出104CFU/mL大腸桿菌。

噬菌體檢測食源性致病菌的大部分方法都是利用噬菌體-宿主細菌之間的專一性，然而，在其他一些方法中并不是利用噬菌體而是利用內溶素酶或噬菌體展示技術(phage display technology)進行檢測。內溶素酶(lysin或endolysin)是由噬菌體吸附感染細菌的后期表達產生，能夠水解細菌的細胞壁，從而釋放出子代噬菌體。內溶素酶能夠在體外高度裂解細菌，且同樣具有專一性[54]，因此有研究利用內溶素酶替代噬菌體裂解細菌，結合ATP生物發光法，檢測致病菌[55]。內溶素酶上含有識別及結合細胞壁特異位點或結構的專一性吸附區域(CBDs)，Kretzer等[56]構建CBD-GFP的重組蛋白成功用于李斯特菌的檢測；噬菌體展示技術是一種用于篩選和改造功能性多肽的技術，通過將編碼多肽的基因片段與編碼噬菌體表面蛋白的基因融合進而以融合蛋白形式表達于噬菌體表面。應用噬菌體展示技術制備的高親和力配體分子或特異性抗體等常被用作探針檢測食源性致病菌[57]。

3 結 論

食品安全問題關系到人類健康和國計民生，隨著經濟社會的不斷發展，必然會對食源性致病菌檢測提出越來越多的要求。噬菌體的檢測途徑并不單一，每種方法都有各自的優缺點，因此在檢測工作中，科學家更傾向于將多種噬菌體檢測方法聯合使用或與其他分子生物學技術、電子傳感器技術、免疫學技術、質譜技術等結合達到更靈敏，更快速，更好的檢測效果。隨著人們對噬菌體認識的逐步深入，噬菌體在食品安全檢測中的應用將越來越廣泛，將更能符合食源性致病菌快速檢測的需要。

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Research Progress of the Use of Bacteriophage to Detect Foodborne Pathogenic Bacteria

LI Meng，WANG Jing-xue*，LIN Hong
(Department of Food Science and Technology, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Foodborne pathogenic bacteria have a significant impact on food safety. Traditional detection techniques are not sufficient to achieve a satisfactory detection results in short time period. Novel methods with rapidity, sensitivity and specificity are highly desired. Bacteriophages are virus-infecting bacteria, which are widespread in environment and have the characteristic of simple structure, high specificity and rapid propagation. Currently, many phage-based methods have been developed for inexpensive, fast and sensitive detection for foodborne pathogenic bacteria. In this paper, the principles and applications of phage-based methods are reviewed.

bacteriophage；pathogenic bacteria；detection method

Q939.48；TS201.3

A

1002-6630(2010)23-0439-08

2010-09-20

國家自然科學基金項目(31071540)

李萌(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為微生物應用。E-mail：mengmengli5213@126.com

*通信作者：王靜雪(1976—)，女，副教授，博士，研究方向為微生物應用。E-mail：snow@ouc.edu.cn