苦瓜皂苷對成骨細胞增殖和ALP的影響

楊志剛，沈宗根，張燕萍

(常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500)

苦瓜皂苷對成骨細胞增殖和ALP的影響

楊志剛，沈宗根，張燕萍

(常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500)

研究苦瓜皂苷對體外培養的新生SD 乳鼠成骨細胞增殖和ALP的影響。以1×10-8～1×10-4mol/L濃度梯度的苦瓜皂苷的MEM含藥培養液對新生 SD乳鼠24h內顱蓋骨進行體外細胞培養，分別用 MTT法和 PNPP法檢測成骨細胞的增殖和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性。結果表明：苦瓜皂苷具有時間和劑量依賴性地促進成骨細胞增殖和提高成骨細胞 ALP活性。

苦瓜皂苷；成骨細胞；ALP

苦瓜(Mo mord ica charanti a L.)是葫蘆科(Cucurbitaceae)苦瓜屬植物，又稱癩葡萄和錦荔枝，屬蔓性一年生蔬菜。《本草綱目》記載：苦瓜“苦寒、無毒、除邪熱、解勞乏、清心明目、益氣壯陽”。皂苷是苦瓜中的主要活性成分。化學研究表明，苦瓜皂苷主要屬于四環三萜類葫蘆素烷型皂苷，由皂苷元和低聚糖構成，具有降血糖、抗氧化、提高免疫能力、提高雌激素水平、抗腫瘤、抗艾滋病毒等生理功能[1-5]。近期研究表明苦瓜皂苷具有防治骨質疏松癥的藥理作用[6]，為研究其作用機理，本實驗利用體外成骨細胞培養技術觀察苦瓜皂苷對成骨細胞增殖和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新生SD乳鼠，清潔級，蘇州大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(蘇)2007-0007，實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2007-0035。

苦瓜皂苷(粉末，純度98%) 南京澤朗醫藥科技有限公司；VD3上海通用藥業股份有限公司；新生牛血清(NCS)、MEM培養基 Invitrogen 公司；胰酶、Ⅱ型膠原酶、二甲基亞砜(D M S O)、四甲基偶氮唑藍(MTT) Sigma公司；ALP試劑盒、TritonX-100 南京建成生物技術公司。

CO2培養箱 Shellab公司；倒置相差顯微鏡 Nikon公司；UV-2450紫外-可見分光光度計 島津公司；酶標儀 Thermo 公司；培養板 Costar公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

苦瓜皂苷和VD3分別溶于DMSO中，用對比稀釋法配制成含12%小牛血清的MEM含藥培養液，藥物終含量分別為：溶媒對照中DMSO 0.01%；苦瓜皂苷組中皂苷含量分別為1×10-8、 1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L；VD3組中VD3含量為1×10-6mol/L。

1.2.2 成骨細胞分離與培養[7-8]

取新生 SD乳鼠 5只(24h內)，75%酒精浸泡 5min，無菌取顱蓋骨，置 D-hanks液中，剔除干凈黏附的結締組織和血管，D-hanks液再次沖洗，放入小瓶中剪碎約1mm3，將骨片移入5mL 0.25%胰蛋白酶溶液，37℃預消化25min，將骨片移入5mL 0.1% II型膠原酶溶液中消化，37℃水浴振蕩，60次/min，45min×2次，將含細胞的消化液1000r/min離心10min，棄上清液，PBS清洗，加入含12%小牛血清的MEM培養液，將沉淀的細胞團塊用培養液制成細胞懸液，混勻計數，按需要密度接種于培養瓶，置5% CO2培養箱37℃孵育，48h后換液，2～3d換液 1次，貼壁率達 80%～90%及時傳代。

1.2.3 成骨細胞傳代

原代細胞培養液加4mL D-Hanks液，漂洗，棄液，加2.5mL 0.25%的胰蛋白酶消化，約4min左右，肉眼觀察薄膜現象，相差倒置顯微鏡觀察細胞間隙變大回縮時棄胰酶消化液，加入6mL含12%小牛血清的MEM培養液，吹打細胞層呈片狀從瓶壁脫落，相差倒置顯微鏡觀察細胞變圓，按1:3瓶比例傳代，置于37℃、5% CO2培養箱培養。

1.2.4 MTT法測定成骨細胞增殖

參照文獻[9]記錄方法，采用第2代成骨細胞消化后制成1×105個/mL的細胞懸液，96孔培養板每孔100μL培養，24h后棄原培養液，按1.2.1節方法分組，分別加含不同藥液血清培養液100μL，放置5% CO2培養箱37℃繼續培養，分別在24、48、72h結束前4h PBS沖洗，更換無血清的MEM培養液，同時加入5mg/mL MTT溶液10μL孵育4h，棄上清液，加100μL酸化的10% SDS過夜，酶標儀570nm波長處比色檢測細胞增殖OD值。

1.2.5 KAPLOW氏法觀察成骨細胞分化

參照文獻[10]記錄方法，選用第2代成骨細胞消化后制成1×105個/mL的細胞懸液，以2mL細胞懸液接種于6孔培養板，24h后換液。將含12%小牛血清含藥MEM培養液分別加入內置有蓋玻片的6孔板內。含藥培養液的藥物終含量分別為：溶媒對照組DMSO 0.01%、苦瓜皂苷組1×10-4mol/L、VD3組1×10-6mol/L，2d換含藥培養液一次，放置5% CO2培養箱37℃繼續培養，6d后進行ALP染色，100倍倒置顯微鏡觀察。

1.2.6 PNPP法測定成骨細胞ALP活性

參照文獻[10] 記錄方法，選用第2代成骨細胞消化后制成1×105個/mL的細胞懸液，24孔培養板每孔1mL培養，24h后棄原培養液，按1.2.1方法分組分別加含不同藥液血清培養液1mL，放置5% CO2培養箱37℃繼續培養，分別于2、3、6d后取出，PBS沖洗，每孔加0.25mL 0.1%的Triton-100溶解細胞膜，10min后按ALP測定試劑盒說明書進行ALP比活性測定。

1.2.7 統計學分析

2 結果與分析

2.1 成骨細胞鑒定

培養第1天可見細胞數量較多懸浮在培養液中，呈圓形，核大而圓位于胞體的一端；24h后細胞全部貼壁，胞體展開呈三角形、多角形、梭形等，核呈卵圓形；對數生長期細胞分裂相多見，有較多的突起互相連接；細胞匯合時呈鋪石狀，并可重疊生長，符合成骨細胞形態學特征。堿性磷酸酶染色，酶活動處呈亮紅顆粒，ALP測定培養液有較高的ALP活性，符合成骨細胞功能學特征。

2.2 苦瓜皂苷對成骨細胞增殖的影響

表1 苦瓜皂苷對新生大鼠顱蓋骨成骨細胞增殖的影響(±s，n=5)Table 1 Effect of treatment withMomordica charantiaL. saponins for different hours on the proliferation ofin vitrocultivated osteoblasts in neonatal rat calvaria (±s，n=5)

表1 苦瓜皂苷對新生大鼠顱蓋骨成骨細胞增殖的影響(±s，n=5)Table 1 Effect of treatment withMomordica charantiaL. saponins for different hours on the proliferation ofin vitrocultivated osteoblasts in neonatal rat calvaria (±s，n=5)

注：*.與溶媒對照組相比，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與溶媒對照組相比，有極顯著性差異(P＜0.01)。

藥物濃度/(mol/L)OD570nm24h48h72h溶媒對照組0.103±0.0180.189±0.0180.218±0.045 1×10-80.105±0.0190.190±0.0160.320±0.048 1×10-70.124±0.0290.195±0.0140.322±0.054苦瓜皂苷組1×10-60.131±0.0270.205±0.0200.364±0.118* 1×10-50.146±0.0380.241±0.039*0.372±0.065** 1×10-40.152±0.022*0.261±0.025**0.395±0.098** VD3組1×10-60.203±0.032**0.268±0.045**0.347±0.058**

由表1可見，苦瓜皂苷作用24h后，1×10-4mol/L濃度組對培養成骨細胞具有促增殖作用，與溶媒對照組比較有統計學意義(P＜0.05)。作用48h后，1×10-5mol/L和1×10-4mol/L 濃度組促增殖作用較為明顯，與溶媒對照組比較有顯著差異(P＜0.05 或P＜0.01)。作用72h后，在1×10-6～1×10-4mol/L濃度范圍內對培養成骨細胞均表現出促增殖作用，與溶媒對照組比較，苦瓜皂苷對成骨細胞的增殖作用具有明顯的統計學意義(P＜0.05 或P＜0.01)。

2.3 苦瓜皂苷對成骨細胞ALP的影響

由圖1 KAPLOW氏法染色細胞圖片可見，與未染色組比較，溶媒對照組成骨細胞經ALP染色后可見有紅色，但偶見紅色顆粒；經苦瓜皂苷作用后，成骨細胞ALP染色呈片狀的紅色，且有較多的紅棕色顆粒著色；VD3組成骨細胞，經ALP染色后呈彌散的紅色，也有一定的紅棕色顆粒著色。

圖1 新生大鼠顱蓋骨成骨細胞KAPLOW氏法染色細胞涂片(×100)Fig.1 KAPLOW staining observations of rat osteoblasts treated and untreated withMomordica charantiaL. saponins (×100)

表2 苦瓜皂苷對新生大鼠顱蓋骨成骨細胞ALP活性的影響(±s，n=3)Table 2 Effect of treatment withMomordica charantiaL. saponins for different hours on ALP activity ofin vitrocultivated osteoblasts in neonatal rat calvaria (±s，n=3)

表2 苦瓜皂苷對新生大鼠顱蓋骨成骨細胞ALP活性的影響(±s，n=3)Table 2 Effect of treatment withMomordica charantiaL. saponins for different hours on ALP activity ofin vitrocultivated osteoblasts in neonatal rat calvaria (±s，n=3)

注：*.與溶媒對照組相比，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與溶媒對照組相比，有極顯著性差異(P＜0.01)。

藥物濃度/(mol/L)成骨細胞ALP活性2d3d6d溶媒對照組0.143±0.0380.149±0.0280.178±0.034 1×10-80.175±0.0390.169±0.0320.203±0.043 1×10-70.194±0.0280.204±0.0440.312±0.105*苦瓜皂苷組1×10-60.235±0.0470.297±0.065*0.323±0.78** 1×10-50.279±0.048*0.334±0.049**0.389±0.053** 1×10-40.325±0.052**0.351±0.085**0.487±0.071** VD3組1×10-60.287±0.053**0.329±0.055**0.347±0.068**

由表2 PNPP法定量分析結果可見，新生大鼠顱蓋骨成骨細胞在苦瓜皂苷培養條件下，其分泌的ALP活性隨著培養時間的延長而逐漸增強。苦瓜皂苷作用2d后，在1×10-5～1×10-4mol/L 濃度范圍內培養的成骨細胞，與溶媒對照組比較，其ALP活性增強(P＜0.05或P＜0.01)。作用3d后，以1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L濃度培養成骨細胞，與溶媒對照組比較，其ALP活性增加明顯(P＜0.05 或P＜ 0.01)。作用6d后，苦瓜皂苷各組ALP活性升高明顯，尤以1×10-7、1×10-6、1×10-5、1× 10-4mol/L 濃度范圍培養的成骨細胞作用更顯著，與溶媒對照組比較呈現顯著的促進作用(P＜0.05 或P＜0.01)。

3 結 論

3.1 成骨細胞具有合成、分泌組成骨基質的膠原和糖蛋白的作用，在維持機體內環境穩定，生理機制調節和骨代謝疾病中發揮主要作用。目前，評定促進骨細胞功能藥物的主要藥效指標有骨細胞增殖評定，ALP測定等。MTT比色法是由Mosman建立的一種快速測定細胞增殖的方法，能反映細胞內的DNA合成狀態[11]。本研究MTT實驗結果表明，苦瓜皂苷在1×10-4mol/L濃度培養成骨細胞24h，與溶媒對照組比較具有促細胞增殖作用，作用時間延長至48h和72h促增殖作用更明顯，表明苦瓜皂苷對成骨細胞具有促增殖作用，且具有時間和劑量依賴性。

3.2 新生大鼠顱蓋骨成骨細胞經ALP重氮鹽法(改良KAPLOW氏法)染色后，鏡下成骨細胞呈現紅色著色，與未染色成骨細胞鏡下所見差異明顯，表明所培養的細胞確為成骨細胞。ALP是成骨細胞所分泌的一種酶蛋白，特異性高，為成骨細胞分化成熟的主要標志之一。ALP在細胞中表達的多少，能合理地反映成骨細胞的分化程度和功能狀態，當成骨細胞活動增強時，ALP活性升高，ALP活性的高表達是成骨細胞分化成熟的早期標志。本研究顯示，與溶媒對照組相比較，苦瓜皂苷組新生大鼠顱蓋骨成骨細胞經ALP重氮鹽法(改良KAPLOW氏法)染色后，ALP染色呈片狀的紅色，且有較多的紅棕色顆粒著色，表明苦瓜皂苷具有促進成骨細胞分泌ALP的功能，進一步的定量研究結果表明苦瓜皂苷具有時間和劑量依賴性地增加成骨細胞分泌ALP的作用。

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Effect of Momordica charantia L. Saponins on Osteoblast Proliferation and Alkaline Phosphatase Expression

YANG Zhi-gang，SHEN Zong-gen，ZHANG Yan-ping
(College of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

The present study was aimed at investigating the effect of Momordica charantia L. saponins on the proliferation and alkaline phosphatase (ALP) expression of in vitro cultivated osteoblasts of new born neonatal SD rats. The in vitro cultivation of new born SD rat (aged within 24 h) osteoblast at gradient concentrations of Momordica charantia L. saponins in MEM medium was performed, and MTT and PNPP assays were used to measure the proliferation and ALP activity of osteoblasts, respectively. Our findings suggest that Momordica charantia L. saponins promote the proliferation and ALP activity of osteoblasts in timeand dose-dependent manners.

Momordica charantia L. saponins；osteoblast；ALP

R965 ；Q946.83

A

1002-6630(2010)23-0383-03

2010-11-23

常熟理工學院青年教師科研啟動基金項目(QZ0811)

楊志剛(1977—)，男，實驗師，碩士，主要從事藥用植物活性成分藥理研究。E-mail：zgy@cslg.cn