產(chǎn)油脂和γ-亞麻酸被孢霉M11的誘變

張 超，徐 洲，魏 琴，李正國*

(1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400044；2.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000)

產(chǎn)油脂和γ-亞麻酸被孢霉M11的誘變

張 超1,2，徐 洲2，魏 琴2，李正國1,*

(1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400044；2.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000)

為了提高被孢霉M11的油脂與γ-亞麻酸(GLA)含量，對M11菌株分別進(jìn)行紫外(UV)、硫酸二乙酯(DES)、紫外與硫酸二乙酯復(fù)合(UV-DES)誘變的研究。結(jié)果表明：UV、DES、UV-DES復(fù)合誘變措施在一定程度上提高了突變菌株的油脂含量及GLA含量，但復(fù)合誘變比單一誘變更有效。突變株M117的油脂含量為41.3%，GLA含量9.28%，GLA產(chǎn)量1.52g/L，分別比出發(fā)菌株提高了11.26%、11.81%和24.59%。經(jīng)9代連續(xù)傳代培養(yǎng)，M117都能保持較穩(wěn)定的產(chǎn)油和產(chǎn)γ-亞麻酸能力。

被孢霉；紫外誘變；硫酸二乙酯誘變；復(fù)合誘變；油脂；γ-亞麻酸

微生物油脂是一種重要和極具開發(fā)潛力的油脂資源[1]，主要含有亞油酸、γ-亞麻酸(GLA)等不飽和脂肪酸，是維持生命的重要營養(yǎng)物質(zhì)。γ-亞麻酸(γ-Linolenic acid，GLA)作為一種人體必需的不飽和脂肪酸，被認(rèn)為對人體具有重要的生理生化作用，具有多方面的藥用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值[2-4]，人體補(bǔ)充GLA已成為抗衰老，預(yù)防和治療某些疾病的一個(gè)重要手段[5-6]。目前，在國內(nèi)由于植物是其主要來源，所以應(yīng)用受到一定限制。由于微生物生產(chǎn)油脂和γ-亞麻酸具有速度快、原料易得、生產(chǎn)過程人工可控等優(yōu)點(diǎn)，一段時(shí)間以來，開發(fā)微生物油脂資源和GLA資源受到眾多研究者的重視[7-8]。我國對微生物發(fā)酵法生產(chǎn)油脂和γ-亞麻酸的研究起步較晚，雖然上海工業(yè)微生物研究所、天津南開大學(xué)微生物系等單位取得了一些研究進(jìn)展，但在菌株產(chǎn)油脂和γ-亞麻酸的水平上與日本和美國相比仍有較大差距[9-10]。

被孢霉是目前研究的較多的重要真菌之一，被孢霉M11已被證明是一種能產(chǎn)生油脂和γ-亞麻酸的絲狀真菌[11]。但由于其油脂和γ-亞麻酸的含量不高，還不具備工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢。因此，如何提高其油脂和γ-亞麻酸含量是值得研究的問題。誘變選育是提高菌株產(chǎn)物產(chǎn)生能力的一種有效方法[12]，因此，本研究用UV、DES、UV/DES復(fù)合誘變方法處理M11，獲得了多株突變菌株。研究

對比了3種誘變方式及其定向篩選的誘變效果，并獲得了9株正突變菌株的搖瓶實(shí)驗(yàn)及M117突變菌株的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

被孢霉M11，由宜賓學(xué)院發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、發(fā)酵工程與食品科學(xué)研究所保存。

保藏培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0、酵母膏2.0、蛋白胨5.0、瓊脂20，pH值自然；活化培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖40.0、酵母膏4.0、蛋白胨7.0、瓊脂20，pH值自然，營養(yǎng)鹽溶液1mL；基本培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖120.0、KH2PO41.8、(NH4)2SO42.0、尿素2.0、酵母膏2.0、蛋白胨5.0，營養(yǎng)鹽溶液1mL；定向篩選培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖120.0、NaCl 1.5、KCl 1.5、KH2PO41.8、(NH4)2SO42.0、尿素2.0、酵母膏2.0、蛋白胨5.0、瓊脂20，營養(yǎng)鹽溶液1mL；營養(yǎng)鹽溶液組成(g/L)[13]：FeSO4·7H2O 10.0、CaCl2·2H2O 1.5、CuSO4·5H2O 1.0、ZnSO4·7H2O 5.0、MnSO4·4H2O 1.0。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化

接種于活化培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3d。

1.2.2 孢子懸浮液的制備

用0.1mol/L磷酸緩沖溶液洗下出發(fā)菌株的斜面孢子，做成適當(dāng)濃度(106～107個(gè)/mL)的孢子懸浮液。

1.2.3 紫外(UV)誘變

紫外誘變基本操作參照文獻(xiàn)[14]。稀釋涂皿時(shí)，采用篩選培養(yǎng)基(3個(gè)重復(fù))，于28℃避光培養(yǎng)3d。與對照組對比，觀察菌落形態(tài)特征，測定活菌數(shù)。

1.2.4 硫酸二乙酯(DES)誘變[14]

取適當(dāng)體積2g/100mL的DES溶液與孢子懸浮液于無菌試管中混勻，使DES質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8g/100mL，在20℃條件下振蕩60min后，加0.5mL的2g/100mL的Na2S2O3終止反應(yīng)。稀釋后取0.2mL涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)3d，與對照組對比，觀察菌落形態(tài)特征，測定活菌數(shù)。

1.2.5 UV-DES復(fù)合誘變

將經(jīng)紫外線照射一定時(shí)間后的孢子懸浮液，接種到基本培養(yǎng)基上，28℃避光培養(yǎng)3d，并制成孢懸液。在無菌試管中按設(shè)定DES濃度梯度混勻孢懸液與2g/100mL的DES溶液，振蕩處理60min 后，加0.5mL 2g/100mL的Na2S2O3終止反應(yīng)。稀釋后涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)3d，與對照組對比，觀察菌落形態(tài)特征，測定活菌數(shù)。

1.2.6 突變菌株培養(yǎng)

在無菌條件下取3d培養(yǎng)物10mL接種于90mL基本培養(yǎng)基內(nèi)，(28±0.5)℃、160r/min振蕩培養(yǎng)7d，測定菌體干質(zhì)量、油脂含量、G L A含量。

1.2.7 孢子數(shù)量測定

采用血球計(jì)數(shù)法[15]。

1.2.8 致死率的計(jì)算

采用誘變前后菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算，即誘變前后的孢懸液按一定濃度梯度都分別涂布3個(gè)平板，于28℃的恒溫培養(yǎng)，計(jì)菌落數(shù)。

1.2.9 正突變菌株的鑒定與計(jì)算

采用脂肪粒染色法[16]，與對照組進(jìn)行比較，根據(jù)脂肪粒密度高低、顆粒大小判斷是否正突變。

1.2.10 菌體干質(zhì)量

一定量培養(yǎng)物經(jīng)抽濾后，于60℃烘干至質(zhì)量恒定。

1.2.11 油脂提取含量測定

采用酸熱法[17]。

1.2.12 GLA測定方法

采用甲酯化-氣相色譜測定法[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線誘變劑量的選擇

圖1 紫外照射時(shí)間與致死率和正突變率的關(guān)系Fig.1 Effect of UV irradiation time on fatality and positive mutation rate

由圖1可以看出，隨紫外照射時(shí)間的延長，致死率逐漸增加，而正突變率則出現(xiàn)先升后降的變化。在照射時(shí)間為120s時(shí)，正突變率最高達(dá)4.9%，此時(shí)菌體致死率為85.4%。綜合考慮致死率、正變率等因素，確

定紫外照射120s是適宜的誘變條件。

2.2 硫酸二乙酯(DES)誘變

圖2 DES濃度與致死率和正突變率關(guān)系Fig.2 Effect of DES concentration on fatality and positive mutation rate

由圖2可知，隨DES質(zhì)量濃度在0.05～0.2g/100mL增加時(shí)，菌體致死率、正突變率增加，正突變率最高達(dá)5.4%；DES質(zhì)量濃度超過0.2g/100mL，致死率繼續(xù)平緩增加，而正突變率下降。從菌體生長狀況來看，DES質(zhì)量濃度為0.05g/100mL和0.1g/100mL時(shí)菌絲團(tuán)生長和染色與對照組幾乎無差異。從0.2g/100mL開始，菌絲團(tuán)數(shù)量減少，染色發(fā)現(xiàn)少量菌絲體與對照組有差異；當(dāng)DES質(zhì)量濃度達(dá)到0.4g/100mL時(shí)，隨DES質(zhì)量濃度的增加，菌絲體生長數(shù)量逐步減少，且形態(tài)瘦小。綜合致死率、正突變率等因素，確定0.2g/100mL的DES質(zhì)量濃度是適宜誘變條件。

2.3 紫外線(UV)與硫酸二乙酯(DES)復(fù)合誘變

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了先用紫外線誘變，然后用硫酸二乙酯進(jìn)行誘變的實(shí)驗(yàn)方案。復(fù)合誘變劑量與致死率、正突變率的關(guān)系如表1所示。

表1 復(fù)合誘變劑量與致死率和正突變率的關(guān)系Table 1 Effect of doses of combined UV irradiation and DES treatment on fatality and positive mutation rate

由表1可知，對被孢霉M11而言，經(jīng)紫外照射，DES處理后，在篩選培養(yǎng)基上生長情況與單一誘變因子的結(jié)果不同。經(jīng)紫外誘變后，在0.4g/100mL的DES質(zhì)量濃度下的致死率100%，這表明復(fù)合誘變比單因子誘變的菌體致死率更高。從染色鏡檢結(jié)果來看，當(dāng)紫外照射時(shí)間90s，DES質(zhì)量濃度是0.2g/100mL 時(shí)，有脂肪粒密度高、顆粒大的菌絲體。綜合致死率、正變率等因素，確定紫外照射時(shí)間90s、0.2g/100mL DES處理60min是較好的M11的復(fù)合誘變條件。

2.43 種誘變方式的比較

分別選取上述3種誘變方式下獲得的染色特點(diǎn)突出的突變菌株各3株，按編號為1～9，接入液體基本培養(yǎng)基中，在相同條件下?lián)u瓶培養(yǎng)7d，測定生物量、油脂、G L A量。結(jié)果如表2所示。

表2 9株正突變株產(chǎn)油脂和γ-亞麻酸比較Table 2 Comparison on the contents of lipid and GLA produced by nine positive mutantd strains

由表2可知，通過誘變，實(shí)驗(yàn)所得到的9株菌株的性能發(fā)生一定變化。單獨(dú)的紫外或DES誘變菌株的菌體生物量雖然變化不大，但菌體的油脂含量和油脂中GLA含量均有提高；復(fù)合誘變突變株的油脂和GLA提高的量最明顯，其中菌株M117的油脂含量達(dá)到41.3g/L，油脂中GLA含量達(dá)到9.28%，GLA產(chǎn)量達(dá)到1.52g/L，分別比出發(fā)菌株提高11.26%、11.81%和24.59%。

2.5 傳代次數(shù)對M117產(chǎn)油脂和γ-亞麻酸穩(wěn)定性的影響

按菌株保藏和液體基本培養(yǎng)方法，將M117接進(jìn)行9代連續(xù)培養(yǎng)，考察傳代次數(shù)對產(chǎn)油脂和γ-亞麻酸的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 傳代次數(shù)對M117性能穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of passage number on the abilities of mutant strain M117 to produce lipid andγ-linolenic acid

由圖3可知，經(jīng)9次連續(xù)傳代后，M117均能保持較穩(wěn)定的產(chǎn)油和產(chǎn)γ-亞麻酸的能力，且油脂產(chǎn)量保持在16.40g/L左右，產(chǎn)γ-亞麻酸的能力保持在1.52g/L左右，分別比出發(fā)菌株(14.74g/L和1.22g/L)提高了11.26%和24.59%。

3 討 論

誘變育種是一項(xiàng)復(fù)雜的工作，高效判斷正突變是該項(xiàng)工作的重要內(nèi)容之一。在實(shí)驗(yàn)方法上，本研究采用蘇丹黑染色法篩選產(chǎn)油正突變菌株；設(shè)計(jì)了高滲透壓篩選培養(yǎng)基，可能對提高目的突變菌株的檢出率有幫助，此方法是否存在漏掉優(yōu)質(zhì)正突變菌株的可能，有待進(jìn)一步研究；從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，復(fù)合誘變比單因素誘變有更高致死率，所獲得的突變體的產(chǎn)油脂及其GLA的能力更強(qiáng)，這表明復(fù)合誘變方法更加有效地提高了與油脂和GLA合成有關(guān)的酶的表達(dá)或活性；通過對M117菌株產(chǎn)油脂和γ-亞麻酸穩(wěn)定性研究，表明該方法所獲得的突變株的遺傳穩(wěn)定性良好；研究結(jié)果與希臘學(xué)者Papanikolaou等[18]報(bào)道的M.isabellina 18.1g/L油脂產(chǎn)量有較大的差距。因此，還有必要對突變菌株的生長條件和工藝方法做進(jìn)一步研究。

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Induced Mutagenesis of Mortierella M11for Improving the Abilities to Produce Lipid and γ-Linolenic Acid

ZHANG Chao1,2，XU Zhou2，WEI Qin2，LI Zheng-guo1,*
(1. College of Bio-engineering, Chongqing University, Chongqing 400044, China；2. Key Laboratory of Fermentation Resource and Application of Institutes of Higher Learning in Sichuan, College of Life Science and Food Engineering, Yibin University, Yibin 644000, China)

In order to improve the productivity of lipid and γ-linolenic acid in Mortierella M11, the mutagenesis of Mortierella M11 was induced by UV irradiation, DES treatment and their combination, respectively. All the three mutant strains of Mortierella M11 obtained exhibited higher contents of lipid and γ-linolenic acid in comparison with it, and the combined induction was the most effective mutagenesis approach. The mutant strain M117 obtained through the combined induction of UV irradiation and DES treatment showed 41.3% lipid content, 9.28% GLA content and 1.52 g/L GLA yield, with incremental percentages of 11.26%, 11.81% and 24.59% as compared to the original strain, respectively. After nine generations of passage, the abilities of this stain to produce lipid and γ-linolenic acid were both kept stable.

Mortierella；UV mutagenesis；DES mutagenesis；combinatorial mutagenesis；lipid；γ-linolenic acid

TS201.3

A

1002-6630(2010)23-0322-04

2010-09-02

四川省教育廳青年基金項(xiàng)目(2002B23)

張超(1966—)，男，副教授，博士研究生，主要從事生物工程與食品生物技術(shù)研究。E-mail：chzh1966@126.com

*通信作者：李正國(1964—)，男，教授，博士，主要從事食品科學(xué)與植物生物技術(shù)研究。E-mail：zgli6@163.com