微生物多糖韋蘭膠生產工藝優化

趙 燕，陳 芳，李建科，廖 斌，涂勇剛

(1.南昌大學 生物質轉化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047；2.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；3.江西農業大學食品科學與工程學院，江西 南昌 330045)

微生物多糖韋蘭膠生產工藝優化

趙 燕1,2，陳 芳1,2，李建科1,2，廖 斌1,2，涂勇剛3

(1.南昌大學 生物質轉化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047；2.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；3.江西農業大學食品科學與工程學院，江西 南昌 330045)

探討韋蘭膠的生產條件，主要包括生產菌株、發酵培養基及發酵工藝條件三方面。通過繪制菌體生長曲線，了解此菌種的生長情況，初步確定二級種子的培養時間。通過單因素試驗及正交試驗，得出韋蘭膠的最佳發酵培養基配方為：蔗糖40g/L、酵母膏3g/L、K2HPO4·7H2O 5g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、FeSO4·7H2O 1mg/L、CaCl20.5g/L；此條件下，韋蘭膠產率由7.31g/L上升到17.23g/L。最佳發酵工藝條件為：接種齡18h、接種量0.5%、裝液量40mL(250mL搖瓶)、初始pH7.0、搖床轉速220r/min、培養溫度30℃、培養時間72h，在此條件下，韋蘭膠產率達20.64g/L。

微生物多糖；韋蘭膠；發酵

微生物多糖是細菌、真菌等微生物在生長代謝過程中產生的生物聚合物[1]。與動植物多糖相比，微生物多糖生產周期短，受外界環境因素的影響相對較小，產量及質量都相對穩定，可以在控制條件的情況下實現工業化生產[2]。以高黏度、水溶性為特征的微生物膠是近年來利用現代生物技術開發的新型微生物多糖，可作為增稠劑、懸浮劑、黏附劑或保水劑，廣泛應用于食品、醫藥、石油和水泥等領域，具有很高的商業價值，尤其是黃原膠、結冷膠和韋蘭膠這3種微生物膠[3-4]。

韋蘭膠(welan gum，welan，編號S-130)，也叫威蘭膠、威倫膠或維蘭膠，是Alcaligenes sp. ATCC 31555產生的胞外多糖，被認為是繼黃原膠、結冷膠之后最具市場前景的第3代微生物膠。研究表明韋蘭膠屬于典型的假塑性流體，具有良好的增稠性、懸浮性、乳化性，尤其是具有耐高溫、耐酸堿、耐鹽性能[5-6]。韋蘭膠水溶液對熱穩定，在溫度升高至149℃時，其黏度基本不變，其耐溫極限值比黃原膠高20～30℃。韋蘭膠水溶液對酸、堿穩定，其黏度在pH2～13范圍內基本不受影響；對鹽的穩定性也高，使其可作為增稠劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑和保水劑應用于工、農業生產的諸多方面。

國外早在20世紀80、90年代就開始研究韋蘭膠的

結構、構象、性質和應用[5-18]，但未見對其發酵和生產方面的報道。我國于近年開始進行韋蘭膠方面的研究[1,19-26]，韋蘭膠搖瓶發酵的產率大多在17g/L左右，僅有少數報道其膠產率超過20g/L；上罐發酵韋蘭膠的產率普遍高于搖瓶發酵的水平。但迄今為止，韋蘭膠在國內還沒有實現工業化生產，美國Kelco公司仍是全球惟一的韋蘭膠生產供應商。本實驗主要對韋蘭膠生產菌株、發酵培養基配方及發酵工藝條件三方面進行探索性研究，以期為韋蘭膠的進一步開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

菌株Alcaligenes sp. ATCC31555購于美國菌種保藏中心。

斜面培養基(g/L)：酵母粉3、蛋白胨4、KCl 5；種子培養基(g/L)：葡萄糖15、蛋白胨7、KCl 5；發酵培養基(g/L)：葡萄糖30、蛋白胨3、CaCl20.5、FeSO4·7H2O 0.001、K2HPO4·7H2O 0.3、MgSO4· 7H2O 0.5。

1.2 儀器與設備

AR1140分析天平、SPS401F電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司；恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；303A-4數顯電熱培養箱 上海浦東榮豐科學儀器有限公司；凈化工作臺 上海新苗醫療機械制造有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊醫療設備廠；752N紫外-可見分光光度計、PHS-3B精密pH計上海精密科學儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱 南京實驗儀器廠；Brookfield DV-Ⅱ+Pro 黏度計 美國Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體生長曲線的繪制

250mL帶擋板的搖瓶裝液量50mL，接種量1%，220r/min、30℃振蕩培養。在0、5、10、15、20、25h時分別取發酵液樣品，測定菌體濃度(OD660nm)、總糖質量濃度、還原糖質量濃度，繪制生長曲線。

1.3.2 發酵培養基的篩選

1.3.2.1 單因素試驗

培養基成分固定FeSO4·7H2O 1mg/L、CaCl20.5g/L，以韋蘭膠產率為主要評價指標，發酵液黏度為參考指標，考察不同碳源、氮源、K2H P O4·7 H2O用量、MgSO4·7H2O用量對韋蘭膠發酵的影響。

1.3.2.2 正交試驗

固定培養基組分中FeSO4·7H2O 和CaCl2質量濃度分別為1mg/L和0.5g/L，在單因素試驗的基礎上，以蔗糖質量濃度(A)、酵母膏質量濃度(B)、K2HPO4·7H2O質量濃度(C)、MgSO4·7H2O質量濃度(D)為因素，各取3水平，以韋蘭膠的產率為指標，進行正交試驗。

1.3.3 發酵工藝條件優化

以韋蘭膠產率為主要指標、發酵液黏度為參考，考察種齡及接種量、培養基裝液量、初始pH值對韋蘭膠發酵的影響。

1.3.4 培養方法

一級種子培養：250mL搖瓶內裝50mL種子培養基，接種活化后的斜面菌種兩環，搖床轉速220r/min，培養溫度30℃，培養時間24h。

二級種子培養：50mL種子培養基(250mL搖瓶)，接種量1%，轉速220r/min，30℃培養15h。

發酵培養：將培養好的種子液按1%的接種量接入裝有50mL發酵培養基的250mL搖瓶中培養、30℃，220r/min，培養72h。

1.3.5 測定方法

還原糖的測定：3,5-二硝基水楊酸(DNS)法；總糖的測定：苯酚-硫酸法；菌體生長量的測定：比濁法；發酵液酸度的測定：用pH計進行測定；發酵液黏度的測定：用黏度計(4號轉子，轉速60r/min)測定；韋蘭膠膠產率的測定：采用乙醇沉淀法測定。稱取適量發酵液，加入2倍體積的95%乙醇沉淀析出韋蘭膠。過濾，烘干，稱質量，提取的韋蘭膠質量與發酵液體積之比即膠產率。

2 結果與分析

2.1 菌體生長曲線

圖1 菌體生長曲線Fig.1 Growth curve of ATCC31555 in seed medium

由圖1可知，菌種在經過10h的延滯期后到達對數生長期。15h后菌體生長較為穩定，20h后菌體生長進入衰亡期。最佳種齡一般處于對數生長期的末期，由此預測本實驗菌種的最佳種齡(即二級種子培養時間)應該在15h左右。

總糖與還原糖的變化趨勢與菌體的生長趨勢保持一

致。在菌體生長的延滯期，總糖與還原糖質量濃度變化不大，進入對數生長期后，總糖與還原糖質量濃度都下降。但總體而言，在整個菌體生長過程中耗糖量不大，糖質量濃度不是該菌生長的主要限制性因素。

2.2 發酵培養基的篩選

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 碳源的選擇

分別選用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、木薯淀粉水解液作碳源進行搖瓶發酵實驗，考察不同碳源對韋蘭膠合成的影響。如圖2所示，菌株在以蔗糖為碳源時發酵液的黏度與膠產率均最高，以葡萄糖或木薯淀粉水解液為碳源也可獲得較高的膠產率，但發酵液黏度偏低。而在以可溶性淀粉為碳源時，菌株幾乎不產膠，發酵液黏度和產膠率均為零，說明該菌水解可溶性淀粉的能力極低。實驗結果表明蔗糖為最佳碳源。

圖2 碳源對韋蘭膠產率和黏度的影響Fig.2 Effect of carbon source on the yield and viscosity of Welan gum

2.2.1.2 氮源的選擇

圖3 氮源對韋蘭膠產率和黏度的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on the yield and viscosity of Welan gum

分別采用蛋白胨、玉米漿、酵母膏、硝酸銨、硫酸銨、尿素作氮源，考察其對膠產率和發酵液黏度的影響。從圖3可知，菌株在以酵母膏為氮源時，發酵液的黏度和膠產率均為最高；以蛋白胨或玉米漿為氮源也可獲得較高的膠產率，但發酵液黏度明顯偏低；以無機氮為氮源，膠產率和發酵液黏度均不理想。這可能是由于有機氮源比無機氮源營養成分豐富，可以提供發酵所需要的其他營養，如氨基酸和維生素等。

2.2.1.3 K2HPO4·7H2O用量的選擇

磷有利于糖的代謝，因此它能促進微生物的生長繁殖；但當磷過量時，許多產物的合成又會受到抑制，故磷用量的選擇非常必要。由圖4可知，在K2HPO4·7H2O質量濃度0～10g/L的范圍內，綜合考慮韋蘭膠產率和發酵液黏度，認為其在發酵培養基中的質量濃度以5g/L左右為宜。

圖4 K2HPO4·7H2O質量濃度對韋蘭膠產率和黏度的影響Fig.4 Effect of K2HPO4·7H2O concentration on the yield and viscosity of Welan gum

2.2.1.4 MgSO4·7H2O用量的選擇

圖5 MgSO4·7H2O質量濃度對韋蘭膠產質量率和黏度的影響Fig.5 Effect of MgSO4·7H2O concentration on the yield and viscosity of Welan gum

鎂是許多重要酶的激活劑和啟動器，因此其用量的選擇也非常關鍵。由圖5可知，M g S O4·7 H2O質量濃度為3g/L左右時韋蘭膠產率最高，發酵液黏度適中。

2.2.2 正交試驗

按1.3.2.2節設計進行正交試驗，試驗設計及結果見表1。

表1 正交試驗設計及結果Table 1 Design and results of orthogonal experiments

表2 正交試驗結果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiments

由表1可知，影響韋蘭膠產率各因素的主次順序為酵母膏質量濃度＞蔗糖質量濃度＞K2HPO4·7H2O質量濃度＞MgSO4·7H2O質量濃度。最佳培養基配方為A2B2C2D1，結合培養基中的固定組分FeSO4·7H2O 1mg/L、CaCl20.5g/L，即最佳培養基配方為：蔗糖40g/L、酵母膏3g/L、K2HPO4·7H2O 5g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、FeSO4·7H2O 1mg/L、CaCl20.5g/L。按此配方進行驗證實驗，韋蘭膠產率達17.23g/L。由表2方差分析可知，蔗糖和酵母膏質量濃度對膠產率的影響都具有顯著性。

2.3 發酵工藝條件的優化

2.3.1 種齡及接種量的選擇

圖6 種齡對韋蘭膠產率和黏度的影響Fig.6 Effect of seed age on the yield and viscosity of Welan gum

通常，接種齡以菌體處于生命力極為旺盛的對數生長期后期，且培養液中菌體量將達到最高峰時較為合適；接種量的大小取決于生產菌種在發酵罐中生長繁殖的速度[27]。本實驗將種齡控制在12～24h，接種量控制在0.5%～4%的范圍內，綜合考察對膠產率和發酵液黏度的影響。結果如圖6～7所示，最佳種齡為18h，最佳接種量為0.5%。綜合圖6與圖1分析，種齡處于菌體對數生長后期有利于發酵生產；當種齡超過穩定期進入衰亡期后，韋蘭膠的生物合成量下降。

圖7 接種量對韋蘭膠產率和黏度的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on the yield and viscosity of Welan gum

2.3.2 裝液量的選擇

韋蘭膠的發酵是好氧的，此類發酵過程中在沒有自動控制溶氧系統的情況下通常采用較少裝液量和提高搖床轉速來控制溶氧。本實驗將裝液量控制在20、40、60、80、100mL(250mL搖瓶)，綜合考察膠產率和發酵液黏度，結果如圖8所示，最佳裝液量為40mL。

圖8 裝液量對韋蘭膠產率和黏度的影響Fig.8 Effect of medium volume on the yield and viscosity of Welan gum

2.3.3 初始pH值的選擇

將培養基的初始pH值分別調節至5、6、7、8、9，分別進行搖瓶培養并測定韋蘭膠的膠產率和發酵液黏度，結果如圖9所示，培養基初始p H值對ATCC31555產膠和膠黏度都有明顯的影響，較優的初始pH值為7。

圖9 初始pH值對韋蘭膠產率和黏度的影響Fig.9 Effect of initial pH on the yield and viscosity of Welan gum

3 結 論

以Alcaligenes sp. ATCC31555為生產菌株，通過對營養條件和環境條件的優化，確定最優的發酵培養基為：蔗糖40g/L、酵母膏3g/L、K2HPO4·7H2O 5g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、FeSO4·7H2O 1mg/L、CaCl20.5g/L；驗證實驗表明，采用優化的發酵培養基，韋蘭膠產率可達17.23g/L。最佳發酵環境條件為：接種齡18h、接種量0.5%、裝液量40mL(250mL搖瓶)、初始pH7.0、搖床轉速220r/min、培養溫度30℃、培養時間72h；在此條件下，韋蘭膠產率高達20.64g/L。

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Fermentation Processing of Microbial Polysaccharide Welan Gum

ZHAO Yan1,2，CHEN Fang1,2，LI Jian-ke1,2，LIAO Bin1,2，TU Yong-gang3
(1. Engineering Research Center of Biomass Conversion, Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. College of Food Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

Optimal preparation conditions such as strain, fermentation medium and fermentation processing parameters were explored. The growth of strain and second stage of seed were achieved by the growth curve of ATCC31555 in medium. The optimal fermentation medium for preparing Welan gum were explored by single factor and orthogonal experiments to be 40 g/L sucrose, 3 g/L yeast extract, 5 g/L K2HPO4·7H2O, 2 g/L MgSO4·7H2O, 1 mg/L FeSO4·7H2O and 0.5 g/L CaCl2. The yield of Welan gum was increased from 7.31 to 17.23 g/L by using the improved medium. The optimal fermentation conditions were the seed age of 18 hours, inoculation amount of 0.5% (V/V), medium volume of 40 mL in 250 mL flask, pH 7.0, shaking speed of 220 r/min, fermentation temperature of 30 ℃ and fermentation time of 72 h. Under the optimal fermentation conditions, the yield of Welan gum was up to 20.64 g/L.

microbial polysaccharide；Welan gum；fermentation

TS201.3

A

1002-6630(2010)23-0219-05

2010-08-15

食品科學與技術國家重點實驗室自由探索課題(SKLF-TS-200822)

趙燕(1980—)，女，助理研究員，博士，研究方向為農產品加工與生物質轉化。E-mail：zhaoyan@ncu.edu.cn