Lactobacillus paracaseiW2合成苯乳酸培養條件的優化

劉 戈，王立梅*

(1.吉林農業大學食品工程學院，吉林 長春 130118；2.常熟理工學院生物與食品工程系，江蘇 常熟 215500；3.蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇 常熟 215500)

Lactobacillus paracaseiW2合成苯乳酸培養條件的優化

劉 戈1，王立梅2,3,*

(1.吉林農業大學食品工程學院，吉林 長春 130118；2.常熟理工學院生物與食品工程系，江蘇 常熟 215500；3.蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇 常熟 215500)

對苯乳酸(PLA)高產菌株副干酪乳桿菌Lactobacillus paracaseiW2的培養條件進行優化，以提高PLA合成能力。采用Plackett-Burman(PB)試驗設計法，篩選出3個主要影響因子：葡萄糖、吐溫-80、苯基丙酮酸(PPA)。通過最陡爬坡法和響應面分析方法(RSM)確定葡萄糖質量濃度19.5g/L、吐溫-80 4mL/L、苯基丙酮酸質量濃度3g/L。在此優化條件下，Lactobacillus paracaseiW2發酵合成苯乳酸的產量達到801mg/L，比優化前提高1.4倍。

Lactobacillus paracaseiW2；苯乳酸；最陡爬坡法；Plackett- Burman設計；響應面分析

苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)，即2-羥基-3-苯基丙酸，也稱β-苯乳酸或3-苯基乳酸，是一種新型的抑菌物質[1-4]。苯乳酸的抑菌譜廣，對革蘭氏陽性細菌如S.aureus、L.monocytogenes，革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌、沙門氏菌和真核微生物如曲霉屬的黑曲霉、黃曲霉，青霉屬的婁地青霉、團青霉等均有抑制作用[5-6]。苯乳酸作為天然防腐劑被應用于食品工業，也用于醫藥和化妝品工業[7-10]。

自1986年以來，國內外已經著手于苯乳酸的研究[11]。它可由多種微生物產生，但由于乳酸菌是GRAS微生物[6]，更適合應用于食品行業。所以，利用乳酸菌生產苯乳酸成為研究的熱點。2000年，Lavermicocca[2]分離到的植物乳桿菌(L.plantarum 21B)生產苯乳酸，產量為56mg/L。隨后研究人員相繼發現了不同種屬的乳酸菌產生的苯乳酸，2002年，SRTROM等[12]分離的L.plantarum MiLAB 393，產生S型和R型3-苯乳酸的比例為9:1。Magnusson等[13-14]從青草中分離出苯乳酸的產生菌株，經鑒定為棒狀乳1桿菌(L ac t o ba c i ll u s coryniformis)。2004年，Valerio等[15]研究發現許多乳酸菌都能產生苯乳酸，但產量比較低。2007年，李興峰[3]從中國傳統的泡菜中篩選的植物乳桿菌(Lactobacillus sp. SK007)產生苯乳酸的量達91mg/L。迄今為止，由副干

酪乳桿菌合成PLA還未報道，本實驗以Lactobacillus paracaseiW2為研究對象，對其搖瓶發酵培養基進行優化，旨在為其規模化發酵及工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與培養基

副干酪乳桿菌Lactobacillus paracaseiW2，本實驗室篩選并在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏。

苯乳酸標準品 Sigma公司；乙酸乙酯、甲酸、葡萄糖、蛋白胨 上海化學試劑廠。

培養基采用MRS培養基。

1.2 方法

1.2.1 PLA的提取

將發酵液離心、過濾后用甲酸調節酸度至pH2，用乙酸乙酯萃取，然后減壓濃縮。

1.2.2 檢測方法

采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)檢測苯乳酸含量。色譜條件：色譜柱：C18柱；流動相：A為0.05%三氟乙酸甲醇溶液，B為0.05%三氟乙酸水溶液；檢測波長：210nm；柱溫：30℃；總流速：1mL/min；進樣量為5μL。

1.2.3 試驗設計

1.2.3.1 Plackett-Burman試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以PLA的濃度作為響應值，選擇培養基組分中的7個因素作為研究對象，即：蛋白胨(X1)、酵母膏(X2)、PPA(X4)、乙酸鈉(X5)、葡萄糖(X7)、吐溫-80(X9)、磷酸氫二鉀(X10)。另外選擇3個虛擬變量，用來估算誤差。本試驗選用10因素，N=12次的試驗表格，篩選出3個主效應影響因子。

1.2.3.2 最陡爬坡試驗設計

根據Plackett-Burman試驗確定的3個重要因素設計最陡爬坡試驗，檢測PLA含量，以確定響應面試驗的中心試驗點。

1.2.3.3 Box-Benhnken中心組合試驗設計

在PB試驗及最陡爬坡試驗的基礎上，選擇影響合成PLA的3個主要因素為自變量，以PLA產量為考察指標，采用Box-Benhnken中心組合試驗設計，進行三因素五水平的RSM試驗，以確定最優濃度。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman 試驗

由表1可知，葡萄糖＞吐溫-80＞PPA在7個考察因素中顯著性最高，葡萄糖是微生物生命活動的能量來源；PPA是PLA的合成前體；吐溫-80作為表面活性劑可以刺激菌體的生長。所以選這3個因素作為重要因素，在以下的研究工作中對其進行進一步的優化。其他4個因素根據效應性選擇試驗水平，即：蛋白胨(X1)選擇高水平，酵母膏(X2)、乙酸鈉(X5)和K2HPO4(X10)選擇低水平。

表1 Plackett-Burman試驗結果Table 1 Results of Plackett-Burman design

主要因素的編碼多元一次回歸方程為：Y=0.664-0.055X4-0.089X7+0.084X9。該方程的相關性R2=0.9395，該模型的實驗結果存在6.74%的失真，相關性較好。

2.2 最陡爬坡試驗

表2 最陡爬坡試驗設計及結果Table 2 Steepest ascent design and experimental results

由表2可知，在0階段的PLA產量最高，可達835mg/L。因此，在以下的響應面試驗中，將0階段試驗組作為中心實驗點。

2.3 Box-Benhnken中心組合試驗及響應面分析

表3 試驗因素水平和編碼Table 3 Levels and codes of factors in central composite design

根據表3試驗因素水平和編碼，以PLA產量為響應

值Y，中心組合試驗結果見表4。

表4 中心組合試驗設計表及試驗結果Table 4 Central composite design matrix and experiment results

20個試驗點可分為兩類：一是析因點，自變量取值在其所構成的三維頂點，共12個析因點；二是零點，為區域的中心點，用以估算實驗誤差。以PLA的產量為響應值，利用SAS軟件對表4的數據進行回歸分析，得到關于PLA產量(Y)對葡萄糖(X1)、PPA(X2)、吐溫-80 (X3)的多元回歸方程：

Y=0.827024+0.004151X1-0.025132X2+0.000323X3-0.066368X12+0.006625X1X2-0.002125X1X3-0.164302X22+ 0.007625X2X3-0.087228X32

該回歸方程R2=0.9601，說明回歸方程和實際擬合效果良好，可以用于試驗結果的分析和預測。

表5 回歸方程系數顯著性檢驗Table 5 Significance tests of regression coefficients of the established quadratic model

由表5的方差分析結果表明，X12、X22、X32對PLA產量的影響極其顯著(P＜0.01)，它們對PLA產量影響的大小順序為：X22=X32＞X12，由此建立的模型也極為顯著，而X1、X2、X3及這3個主效應因子之間的交互作用對PLA產量的影響不顯著(P＞0.05)，由此可見各試驗因子對響應值的影響不呈線性關系，而是呈二次拋物面關系。

圖1 PLA產量響應面立體分析圖Fig. 1 Three-dimensional response surface diagrams showing the pairwise interactive effects of three factors on PLA production

由圖1可知，該回歸方程存在極大值點。該組圖對3個主效應因子對PLA產量的兩兩交互作用進行了評價。根據回歸方程，可得到最佳因素編碼：X1=0.028、X2=-0.076、X3=-0.002，對應的真實值近似為：葡萄糖19.5g/L、PPA 3g/L、吐溫-80 4mL/L。在此最優培養基條件下，PLA的預測產量為828mg/L。為了驗證模型的有效性和準確性，用最優的培養基進行發酵試驗，得到的PLA的真實產量為801mg/L，是優化前發酵培養基產量的1.4倍，可真實的反應各因素對PLA產量的影響。

3 結 論

本實驗在單因素的基礎上，通過PB試驗設計從影響PLA合成的Lactobacillus paracaseiW2發酵培養基中找出3個主效應因子，分別為葡萄糖、PPA、吐溫-80，其他因素選取各自的最佳水平。然后通過Box-Benhnken中心組合試驗設計對這3個主要因素進行進一步優化，其優化后的培養基配方為葡萄糖19.5g/L、苯丙酮酸3g/L、吐溫-80 4mL/L。在此條件下，苯乳酸的產量為801mg/L，比優化前提高了1.4倍。

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Optimization of Culture Medium for Phenyllactic Acid Production by Lactobacillus paracasei W2

LIU Ge1，WANG Li-mei2,3,*
(1. College of Food Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China；2. Department of Biotechnology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China；3. Suzhou Key Laboratory of Food and Biotechnology, Changshu 215500, China)

The optimal medium for phenyllactic acid (PLA) production by Lactobacillus paracasei W2 was investigated in order to improve PLA yield. Three most significant components affecting PLA production were selected out of seven components using Plackett-Burman design, namely glucose, Tween-80 and phenylpyruvic acid. Their optimal concentrations were determined by steepest ascent method and response surface methodology (RSM) to be 19.5 g/L, 4 mL/L and 3 g/L, respectively. PLA production reached 801 mg/L under these conditions, 1.4-fold higher than before optimization.

Lactobacillus paracasei W2；PLA；steepest ascent method；Plackett-Burman design；response surface methodology

Q939.11

A

1002-6630(2010)23-0174-04

2010-09-15

江蘇省科學技術局(BE2008391)；常熟市科技局資助項目(CN200921)

劉戈(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為生物化學與功能性食品。E-mail：liuge19840512@163.com

*通信作者：王立梅(1964—)，女，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：wlmqb@126.com